七氟醚麻醉对肺癌大鼠JAK/STAT信号通路及脑神经损伤的影响

喻晶晶 易菲妮 卢承志 易云峰 张文龙 陈 俊

肺癌是全球发生率最高的呼吸道恶性肿瘤，其发病机制与吸烟、被动吸烟、空气污染、机体免疫力改变等因素密切相关[1-3]。JAK/STAT信号通路的激活与血管内皮损伤、体内炎症反应、肿瘤细胞的增殖分化等密切相关[4-5]。研究表明，抑制JAK/STAT信号通路的激活能够抑制肺癌细胞的增殖、分化及迁移，所以肺癌的发病机制及疾病进展可能与JAK/STAT信号通路的激活密切相关[6-7]。七氟醚是一种常用的吸入型手术麻醉用药，在体内主要在肺内被清除代谢，有研究表明七氟醚能够引起大鼠学习及记忆能力的下降[8-12]。对于肺癌手术患者吸入七氟醚进行麻醉时对其肺组织细胞及脑神经的影响，目前尚无明确报道。本文通过研究七氟醚麻醉对肺癌大鼠JAK/STAT信号通路的影响及脑神经损伤作用，为七氟醚在肺癌患者手术麻醉中的应用提供参考。

材料与方法

一、实验动物

健康雄性SD大鼠24只，SPF(Specific pathogen Free)级别，6周龄，体重(180±20)g，购买于长生生物技术有限公司(许可证号SCXK(辽)2015-0003)，动物房温度(22±2)℃，湿度(50±10)%，购买后进行72 h适应性饲养，自由进食、饮水。

二、试剂与器械

七氟醚购买自江苏恒瑞医药股份有限公司(国药准字H20040772)，抗体STAT3、GAPDH、JAK2、p- JAK2、p-STAT及TNF-α、IL-6及IL-1β水平检测试剂盒、RNA提取试剂盒、RIPA蛋白裂解液购自上海碧云天公司，ECL显色液购自Thermo公司， Morris水迷宫及图像自动采集和处理系统购自基尔顿生物科技(上海)有限公司，双垂直电泳仪、转印电泳仪、凝胶成像仪均购自伯乐生命医学产品有限公司。

三、实验方法

1. 肺癌大鼠模型的建立： 参照文献[13-15]方法，将Walker-256癌细胞使用含10%胎牛血清的RMPI-1640培养液培养至对数增长期，收集Walker-256细胞，将Walker-256细胞调整为密度呈1×107个/ml的细胞悬液，然后将细胞悬液按照0.2 ml/只接种到KM小鼠腹腔，1周内出现腹水。使用无菌注射器抽取KM小鼠Walker-256细胞腹水，用生理盐水稀释后，调整细胞密度为0.5×105个/ml，按照0.2 ml/只，经SD大鼠尾静脉注射腹水细胞悬液，继续喂养3周后，使用高分辨率数字小动物X线机对所有大鼠行胸部影像学检查，观察到肺部肿物形成视为造模成功。

2. 动物分组及七氟醚麻醉： 造模完成后将所有肺癌模型大鼠随机分为4组，每组6只，分别为模型组、七氟醚A组、七氟醚B组、七氟醚C组。麻醉前对各组大鼠禁食禁饮8 h，然后将大鼠置于60 cm×30 cm×25 cm的透明麻醉箱内，七氟醚A、B、C组吸入3%七氟醚+2 ml/min氧气，持续时间吸入分别为4、6、8 h进行麻醉，模型组吸入空气，持续吸入时间6 h。各组大鼠麻醉结束苏醒后正常饮食，麻醉结束24 h后进行后续实验。

3. 大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平的测定： 对各组大鼠通过眼眶后静脉丛取血至干净离心管中，于4 ℃静置4 h，然后置于离心机中，4 ℃，以离心半径8 cm，3 500 r/min，离心10 min。取上清液，按照ELISA 试剂盒说明书检测大鼠血浆中TNF-α、IL-6及IL-1β水平。

4. Morris水迷宫实验： 利用Morris水迷宫，对各组大鼠进行定向航行实验和空间探索实验。将各组大鼠放入水槽自由游泳2 min，适应迷宫内、外环境及游泳状态，持续训练3 d，2次/d；于第4天，进行定位巡航实验，大鼠从4个不同的标记点分别入水，记录其自入水到爬上平台所需要的时间，记为大鼠的逃避潜伏期，如果大鼠在90 s内未找到平台，则将其引导至平台休息10 s，逃避潜伏期记为90 s。定位巡航结束后进行1 d的空间探索实验：撤出平台，将大鼠放入水中自由游泳，记录各组大鼠首次穿过平台所在象限需要的时间以及在90 s内穿过平台的次数。采用Morris水迷宫图像自动监视处理系统完成数据的采集和处理。

5. 实时定量PCR检测： 颈椎脱臼处死后取大鼠海马组织，采用RNA提取试剂盒分别提取各组大鼠海马组织的总RNA。将提取的总RNA逆转录成cDNA后，实时定量PCR检测各组大鼠海马组织中β-actin、caspase-3和caspase-12 mRNA的水平。各检测基因的实时定量PCR引物见表1，实时定量PCR结果采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。

表1 用于实时定量PCR检测的基因引物序列

6. Western blot实验： 大鼠颈椎脱臼处死后迅速分离大鼠肺组织，用4 ℃预冷的生理盐水去除表面血液后，用滤纸吸干表面水分，将大鼠肺组织放入玻璃匀浆器中，加入RIPA蛋白裂解液，用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解，置于4 ℃离心机以离心半径8 cm，12 000 r/min，离心10 min，用移液枪将上清液移至另一干净离心管中，并向其中加入SDS loading buffer，混匀后放入100 ℃水浴5 min，然后放入-20 ℃储存备用。将冻存的大鼠肺组织蛋白液于室温下融化后，采用BCA法测定蛋白浓度，处理好待测样品后，取50 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，转膜，将分离的蛋白电转移至PVDF膜上。封闭液室温封闭1 h，经JAK2、STAT3、p- JAK2、p-STAT3及GAPDH抗体(1︰1 000)4 ℃孵育过夜。PBST充分洗膜后，加入二抗(1︰2 000)室温孵育1 h，PBST清洗后显色液显影，利用凝胶成像仪成像后，进行灰度值检测。

四、统计学方法

结 果

一、七氟醚麻醉对肺癌大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平的影响

各组大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平，见表2。结果表明，与模型组相比，接受不同时间长度七氟醚麻醉的肺癌大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平均显著升高(P<0.05)，且随着七氟醚吸入时间的延长，各七氟醚麻醉组大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平均逐渐增加，提示持续吸入七氟醚进行麻醉能够使肺癌大鼠体内炎症因子水平显著升高，且随着麻醉时间的延长，作用效果增强，进而可能加重肺癌大鼠的疾病状态，引起大鼠全身炎症反应，加速疾病进展。

表2 各组大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平

注：与模型组相比，aP<0.05；与七氟醚A组相比，bP<0.05；与七氟醚B组相比，cP<0.05

二、七氟醚麻醉对肺癌大鼠学习记忆能力的影响

各组大鼠学习记忆能力，见表3。结果表明，与模型组相比，不同时间长度七氟醚麻醉组肺癌大鼠逃避潜伏期及首次穿过平台时间均显著延长(P<0.05)，各麻醉组大鼠90s内穿过平台的次数显著减少(P<0.05)，且随着七氟醚麻醉时间的延长，肺癌大鼠逃避潜伏期及首次穿过平台时间逐渐增加，90 s内穿过平台次数逐渐减少；提示七氟醚麻醉能够使肺癌大鼠学习记忆能力显著降低，且随着七氟醚麻醉时间的延长，大鼠学习记忆能力下降越明显。

表3 各组大鼠学习记忆能力

注：与模型组相比，aP<0.05；与七氟醚A组相比，bP<0.05；与七氟醚B组相比，cP<0.05

三、七氟醚麻醉对肺癌大鼠海马组织caspase-3、caspase-12 mRNA水平的影响

各组大鼠海马组织caspase-3、caspase-12 mRNA水平，见表4。结果表明，与模型组相比，不同时间长度的七氟醚麻醉组肺癌大鼠海马组织caspase-3、caspase-12 mRNA水平均显著升高(P<0.05)，且随着七氟醚麻醉时间的延长，七氟醚各组大鼠海马组织caspase-3、caspase-12 mRNA水平也逐渐增加；提示七氟醚各麻醉组大鼠学习记忆能力下降可能与其海马组织中凋亡相关基因的表达增加有关，随着肺癌大鼠吸入七氟醚麻醉时间的延长，海马组织中凋亡基因的表达显著增加，且进而可能导致肺癌大鼠脑神经出现不同程度的损伤，影响加重肺癌大鼠的疾病状态。

表4 各组大鼠海马组织caspase-3、caspase-12 mRNA水平

注：与模型组相比，aP<0.05；与七氟醚A组相比，bP<0.05；与七氟醚B组相比，cP<0.05

四、七氟醚麻醉对肺癌大鼠肺组织JAK/STAT通路的影响

各组肺癌大鼠肺组织JAK2、STAT3水平，见图1。结果表明，与模型组相比，不同时间长度的七氟醚麻醉组肺癌大鼠肺组织JAK2、STAT3水平均显著升高(P<0.05)， JAK2及STAT3磷酸化比例显著增加(P<0.05)，且随着七氟醚麻醉时间的延长，肺癌大鼠肺组织JAK2、STAT3水平均逐渐增加，其磷酸化水平也逐渐增加；提示接受七氟醚麻醉能够激活肺癌大鼠肺组织JAK/STAT通路，促进相关通路蛋白的表达，这可能促进肺癌大鼠疾病的进一步进展恶化，肺组织细胞功能进一步减退，加重肺癌大鼠病理状态及疾病进展。

讨 论

原发性支气管肺癌简称肺癌，是目前世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一[1-3]。研究表明，吸烟、环境污染、职业暴露、肺癌家族史及既往肿瘤病史、年龄及长期肺部疾病都是肺癌的危险因素，且表现出地区差异、性别差异等特点[16-18]。近年来，随着我国经济发展及工业化进程的加速，肺癌发生率逐年升高，但由于目前医学水平有限，还没有发现能够治愈肺癌的特效药物，对于肺癌的治疗目前临床上主要采用手术切除、放疗、化疗、免疫治疗及靶向治疗等手段[3，19-21]。

JAK即Janus Kinase，是一种非受体型酪氨酸蛋白激酶(PTK)，STAT即Signal transducers and activators of transcription，又称为信号传导及转录激活因子。JAK/STAT信号通路是细胞因子受体系统的重要组成部分，参与细胞增殖、分化以及抗病原性等生理过程。研究表明，肺癌、胃癌、肝癌、人脑胶质瘤等肿瘤的发生发展过程中均有JAK/STAT信号通路的参与[21-23]。同时， JAK/STAT信号通路的激活与血管内皮损伤、体内炎症因子的释放、脑神经损伤等疾病的发病机制也存在密切联系[4-7]。JAK2/STAT3突变及过度磷酸化则能够促进肺癌患者的病情进展，同时诱发癌细胞向全身转移[24-25]。相反，抑制JAK/STAT信号通路的过表达，则能够促进前列腺癌细胞自噬凋亡、抑制胃癌血管生成、抑制肺癌的淋巴结转移[26-28]。

本文通过采用尾静脉注射Walker-256癌细胞悬液法建立大鼠肺癌模型，肺癌大鼠持续吸入4、6 h及8 h的七氟醚进行麻醉后，与模型组相比，七氟醚各麻醉组肺癌大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平均显著升高，提示持续吸入七氟醚进行麻醉能够使肺癌大鼠体内炎症因子水平显著升高，且随着麻醉时间的延长，作用效果增强，进而可能加重肺癌大鼠的疾病状态；肺癌大鼠逃避潜伏期及首次穿过平台时间均显著延长，90 s内穿过平台的次数显著减少，海马组织caspase-3、caspase-12 mRNA水平均显著升高，提示随着肺癌大鼠吸入七氟醚麻醉时间的延长，导致海马组织中凋亡基因的表达显著增加，进而导致肺癌大鼠脑神经出现不同程度的损伤，表现为大鼠学习及记忆能力显著减退；肺组织JAK2、STAT3水平均显著升高， JAK2及STAT3磷酸化比例显著增加，提示接受七氟醚麻醉能够激活肺癌大鼠肺组织JAK/STAT通路，促进相关通路蛋白的表达，这可能促进肺癌大鼠疾病的进一步进展恶化，肺组织细胞功能进一步减退，加重肺癌大鼠病理状态及疾病进展。

图1 各组肺癌大鼠肺组织JAK2、STAT3水平；注：与模型组相比，*P<0.05

海马体是与大鼠学习记忆能力密切相关的组织，海马体中caspase-3、caspase-12等凋亡相关的基因的激活与表达，能够导致大鼠脑神经损伤，进而引起大鼠学习及记忆功能障碍[8-12]。七氟醚主要在肺部清除代谢，肺癌大鼠肺组织细胞功能异常，本文研究结果表明七氟醚麻醉肺癌大鼠能够促进其肺组织JAK/STAT通路相关蛋白的表达，促进该通路的激活，进而促进肺癌大鼠疾病进一步进展恶化，使得肺组织细胞对七氟醚的代谢清除能力降低，进而导致了七氟醚在肺癌大鼠体内累积量增加及停留时间的延长，造成肺癌大鼠脑神经损伤，学习及记忆能力显著下降。本实验研究提示，对肺部疾病的大鼠模型使用七氟醚进行麻醉时应注意对时间的控制，以免造成对大鼠的脑神经及肺组织细胞的进一步损伤，也为七氟醚在临床麻醉中的应用提供了一定的参考。

综上所述，七氟醚麻醉能够激活肺癌大鼠JAK/STAT信号通路，并可通过促进肺癌大鼠海马体凋亡基因的表达引起大鼠脑神经损伤，影响肺癌大鼠学习及记忆能力。