N-乙酰半胱氨酸与IL-27对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化的影响

胡新春 李昌波 孙 杰 邓超英 肖华毅 刘 翱

肺纤维化是一种难治性、高死亡率的肺间质性疾病，肺纤维化病因广泛，主要类型包括已知原因所致肺纤维化、特发性间质性疾病、肺结节病、其他类型的肺纤维化等。除已知原因类型肺纤维化外，其他类型的肺纤维化治疗前景堪忧，无特效药物。肺纤维化发展为终末期，导致呼吸衰竭，肺移植是唯一的治疗方法。但肺移植后长期的抗免疫宿主排斥治疗，容易继发感染死亡[1-2]。因此探索肺纤维化的早期干预方法，可以有效改善肺纤维化预后。N-乙酰半光氨酸(N- acetylcysteine, NAC)近年来已被证实对部分肺纤维化具有一定的抗氧化作用，并在一定程度上可抑制肺纤维化的进程，但临床应用效果差且局限性大[3]。近年来研究发现，通过对博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠模型分别注射IL-27及IL-27R，发现IL-27能有效抑制肺纤维化[4-5]。本文旨在探讨NAC及IL-27对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化的影响。

材料与方法

一、实验材料

采购6～8周龄SPF级雄性C57/BL6小鼠80只，平均体质量(20±1.8)g，小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司。实验动物全部饲养于四川省内江市医科学校基础实验室，饲养环境为无特殊病原(SPF级)。注射用博莱霉素粉针剂(bleomycin, BLM)(日本化药株氏会社)，IL-27重组蛋白注射剂(美国Ebioscience公司)，N-乙酰半胱氨酸泡腾片(NAC)(海南赞邦制药有限公司)，羟脯胺酸试剂盒(武汉华美生物科技有限公司)。

二、实验方法

将80只C57/BL6小鼠随机分为正常组(A组)、BLM模型组(B组)、BLM+IL-27组(C组)、BLM+NAC组(D组)；每组各20只；B、C、D组共60只小鼠统一在同时造肺纤维化模型后再随机分配，每组各20只。10%水合氯醛麻醉全部小鼠进行造模，造模方法采用国际普遍的肺纤维化造模方法，即分离颈部皮肤，暴露支气管后一次性气管内注射药物法；A组小鼠支气管内注射生理盐水0.05 ml，B、C、D组小鼠气管内注射博莱霉素溶液0.05 ml(5 mg/kg)复制肺纤维化模型。C组造模后1 d开始腹腔皮下注射小鼠IL-27重组蛋白溶液1 μg/(只·d)，连续注射7 d[6-8]；D组造模前1周开始灌胃NAC溶液3 mmol/(kg·d)，造模后继续每天灌胃NAC溶液直至处死[9-11]。

小鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，将小鼠固定于实验动物台面，剪去颈部毛发，局部消毒，无菌剪刀剪破颈部皮肤长约1 cm；暴露皮下肌肉，用止血钳和无齿镊钝性分离皮下肌肉，充分暴露气管；使用1 ml注射器经气管软骨环间隙穿刺，回抽无阻力后迅速向气管内注入博莱霉素溶液0.05 ml(5 mg/kg)注射后立即将小鼠直立旋转2 min，尽量使博莱霉素溶液均匀分布于两肺底[12-14]。缝合伤口，麻醉复苏后饲养于SPF级环境内。在正式实验开始前，按照文献步骤行肺纤维化模型建立的预实验，按照文献步骤经小鼠支气管注入博来霉素溶液，于28 d处死小鼠，取左肺组织切片做HE染色评价肺纤维化程度，参照文献进行肺纤维化评分[15]。结合文献及预实验证实经支气管注入博来霉素溶液造肺纤维化模型切实可行。

各组小鼠均在造模后7、14、28 d分别处死5只小鼠，充分放血后获取两侧肺组织，左肺组织用10%福尔马林溶液固定，24 h后进行石蜡包埋并切片行HE染色和Masson染色；右肺组织迅速置入液氮后转入-80 ℃冰箱保存，用以羟脯胺酸测定及备用。光镜下观察肺组织，采用Szapiel等评价肺纤维化程度评分和肺泡炎计分[16]。羟脯胺酸含量测定的操作步骤按试剂盒说明书进行。

三、统计学方法

结 果

一、各组小鼠肺组织病理变化

显微镜下显示：7 d：A组小鼠肺组织结构完整，间质未见渗出及肿胀，无炎性细胞浸润，肺泡内无渗出液；B组小鼠肺组织肺泡壁水肿，间质增厚、肺泡腔变小，肺泡腔内及间质内可见大量红细胞、淋巴细胞浸润，下肺及胸膜下较重；Masson染色肺间质内可见少量胶原蛋白，胶原蛋白和肺泡炎同时存在；C、D组镜下肺组织炎症较B组轻，但C组较D组轻。14 d：A组镜下肺组织表现与7 d时无明显变化；B组小鼠肺组织肺泡壁仍有水肿，肺泡腔较前继续减小，肺泡及间质内可见较多淋巴细胞浸润，部分肺泡塌陷；Masson染色肺间质可见较多胶原蛋白形成，呈网状分布；C、D组肺组织炎症及胶原蛋白染色程度均较B组轻；但C组较D组轻。28 d：A组镜下肺组织病理变化较前不明显；B组肺组织肺泡及肺间质内可见少许淋巴细胞浸润，间质明显增宽，肺泡腔塌陷，肺组织正常结构消失，部分区域实变；Masson染色可见肺间质内大量粗大的胶原蛋白，呈网状分布；C、D组炎症反应较B组轻，胶原蛋白较B组明显减少，但C组较D组轻，见图1～2。

二、各组小鼠肺组织肺泡炎症评分

不同时间点肺泡炎评分：A组小鼠肺组织各时间点均无肺泡炎；B、C、D三组小鼠7 d肺泡炎最明显，评分最高，随着时间推移肺泡炎逐渐减轻，B、C、D组不同时间点肺泡炎评分组间差异具有统计学意义(P<0.05)。相同时间点：7、14、28 d时各组肺组织肺泡炎症评分均表现为相同趋势，如下：B组肺泡炎症评分最高，D组其次，C组较B、D组评分低，A组正常；相同时间点组内差异具有体统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 肺组织病理肺泡炎评分

三、各组小鼠肺组织肺纤维化评分

不同时间点肺纤维化评分：A组小鼠肺组织各时间点均无肺纤维化表现；B、C、D三组小鼠第28天肺纤维最明显，评分最高；第14天肺纤维化其次；第7天肺纤维化最轻。B、C、D组不同时间点肺纤维化评分组间差异具有统计学意义(P<0.05)。相同时间点肺纤维化评分：7、14、28 d时各组肺组织肺纤维化评分均表现为相同趋势，如下：B组小鼠肺组织肺纤维化最明显，评分最高，D组其次，C组较B、D组评分低，A组正常，相同时间点组内差异具体统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 肺组织病理肺纤维化评分

四、各组小鼠肺组织羟脯氨酸含量

不同时间点各组小鼠肺组织羟脯胺酸含量：A组各时间点羟脯氨酸无明显变化；B、C、D组均在28 d羟脯氨酸含量最高，14 d其次，各组均在第7天羟脯胺酸含量最低；不同时间点各组间羟脯胺酸含量差异具有统计学意义(P<0.05)。

相同时间点各组内小鼠肺组织羟脯胺酸含量： 7、14、28 d时羟脯胺酸变化与各组肺组织肺纤维化评分表现为相同趋势，B组羟脯胺酸含量最高，D组其次，C组肺组织羟脯胺酸含量较B、C低，A组正常，相同时间点内各组内羟脯胺酸含量差异具体统计学意义(P<0.05)，见表3。

图1 各组小鼠肺组织病理变化图(HE×40)

表3 各组肺组织中羟脯氨酸含量

讨 论

白介素27(interleukin-27, IL-27)是2002年由美国Pflanz等发现命名的一种新的IL-6/IL-12家族的细胞因子，由EB13和p-28亚基组成，两条多肽链通过二硫键连接构成的异源二聚体，P28不与EB13结合时无生物学活性。IL-27由抗原提呈细胞产生，IL-27在机体内发挥着促进和抑制炎症的双重作用。IL-27调节辅助性T淋巴细胞(T helper cells, Th)的分化，可以促进初始CD+4增殖，使其向Th1分化，同时抑制Th2和Th17的生长，而在Th1高度活跃的时候，又会抑制Th1的应答强度。现已证实，IL-27在抗肿瘤、自身免疫性疾病、炎性肠病、抗感染、哮喘等方面有积极的作用，其主要的作用机制是调节免疫分化[17]。目前国内外对于IL-27在肺纤维化中的作用研究比较少。研究证实IL-27可抑制博莱霉素诱导的肺纤维化进程，IL-27发现效应的时间段主要是在肺间质炎症期，作用机制是抑制细胞STANT信号通路的磷酸化，从而起到抗炎作用[4]。

NAC作为黏液溶解剂广泛用于治疗慢性阻塞性肺疾病、慢性支气管炎，具有较好的安全性。有证据显示，氧化/抗氧化失衡和氧化应激在肺泡上皮细胞的损伤和纤维化中起重要作用。相对正常人而言，IPF患者肺中缺乏一些重要的抗氧化剂，如谷胱甘肽、超氧化化物歧化酶(SOD)，其中谷胱甘肽尤为重要。NAC可以通过细胞膜转化为半胱氨酸，是谷胱甘肽的前体，具有灭活活性氧、稳定细胞结构和稳定细胞内酶和蛋白质的功能[18]。有研究发现，NAC可通过提高谷胱甘肽水平抑制TGF-β诱导的动脉内皮细胞的生长或直接改变TGF-β的分子结构，抑制胶原蛋白的合成，从而抑制肺纤维化的程度。研究证实NAC可通过清除氧自由基，减轻各种有害因子对肺组织的损伤[19-21]。多项NAC治疗肺纤维化的Meta分析表明，长期服用NAC可有效改善IPF患者的临床症状、氧分压、VC(%)、DLco(%)，长期服用NAC未见不良反应报道[22-24]。有研究发现NAC改善IPF患者呼吸困难评分效果明显优于糖皮质激素[25]，缓解临床症状效果显著优于环磷酰胺，而副作用明显更小[26]。

图2 各组小鼠肺组织病理变化(Masson×100)

羟脯胺酸是机体胶原蛋白的重要组成部分，是胶原蛋白中特有的一类氨基酸，羟脯胺酸约占胶原蛋白总量的13.4%，故测定羟脯胺酸的含量可以换算出肺组织中胶原蛋白含量。目前测定羟脯胺酸的含量已经成为评估肺组织纤维化的常用方法。检测羟脯胺酸可以推测出胶原蛋白的含量，故羟脯胺酸与肺纤维化成正比[27-28]。

近年来，有研究发现NAC并不是对所有特发性肺纤维化患者有效，Oldham等[29]研究发现，肺泡内皮细胞表面表达TOLL样受体，NAC通过激活TOLL样受体发挥抗氧化作用，但TOLL样受体可细分为CC、CT、TT基因型，不同的患者表达不同的基因型，NAC抗氧化效果与基因型密切相关；表达CC基因型的患者NAC可加重肺纤维化，CT基因型无明显变化，TT基因型患者肺纤维化明显减轻。

综上所述，IL-27与NAC均具有抗小鼠肺纤维化作用，但IL-27抗炎、抑制肺组织胶原蛋白形成效果明显优于NAC，不排除小鼠肺组织表面表达与人肺组织具有相同的TOLL样受体基因型，需要进一步研究各自的抗炎机制。本研究再次证实IL-27能有效干预肺纤维化的进程，为进一步研究肺纤维化的病因及治疗方法提供了一定的借鉴意义。