儿童感染碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌耐药性及耐药基因型分析

曹静平，景春梅

[重庆医科大学附属儿童医院检验科/儿童发育疾病研究教育部重点实验室/国家儿童健康与疾病临床医学研究中心(重庆)/儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地 400014]

鲍曼不动杆菌(Acinetobacten baumannii，Ab)是一种非发酵的革兰阴性杆菌，广泛分布于水、土壤、人体皮肤及医院环境[1]，常引起菌血症、肺炎、脑膜炎、尿道感染、皮肤和伤口感染[2]。随着碳青霉烯类药物的广泛使用，出现了碳青酶烯类耐药鲍曼不动杆菌(CRAb)，给临床抗感染治疗带来了较大的困难，对医院感染的控制提出了新的要求。已经证明耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌主要是产D类碳青霉烯酶[3]，由 blaOXA-51-like,blaOXA-23-like,blaOXA-24-like,andblaOXA-58-like基因编码。

1 材料与方法

1.1菌株来源 1 324株鲍曼不动杆菌收集自重庆医科大学附属儿童医院，其中重症医学科(ICU)57株，新生儿病房60株，烧伤整形病房13株，呼吸病房10株，共分离非重复的CRAb 155株，其中来自痰液标本136株，分泌物14株，脓液3株，灌洗液1株，导管1株。所有菌株均使用BD Phoenix自动微生物系统进行鉴定。以大肠埃希菌ATCC25922及铜绿假单胞菌ATCC27853作为质控菌。

1.2仪器与试剂 哥伦比亚血平板购自重庆庞通公司，药敏纸片购自法国BioMerienx公司，Taq酶、PCR试剂购自大连宝生生物公司，PTC-100型聚合酶链反应(PCR)仪购自美国MJ-Research公司，TG16W微量高速离心机购自长沙湘仪离心机仪器有限公司，THZ-C恒温振荡器购自江苏太仓市实验设备厂，DYY-2C型电泳仪购自北京六一仪器厂。

1.3药物敏感性测试 用K-B法进行药敏试验，药敏结果按“美国临床试验标准化委员会标准”判读。

1.4模板DNA的制备 采用水煮法：取保存的鲍曼不动杆菌接种至哥伦比亚血平板培养过夜，接种环挑取数个菌落于200 μL，煮沸10 min，14 000 r/min离心10 min，用于PCR的模板DNA的终浓度为50～100 ng/μL。

1.5PCR扩增碳青霉烯酶基因 根据GenBank数据库已收录的碳青霉烯酶基因序列信息，设计扩增OXA-23基因，OXA-24基因，OXA-51基因，OXA-58基因，VIM2基因、SIM1基因，blaOXA-23-like、blaOXA-24-like上游ISAba1启动元件引物序列，引物由上海生工公司合成。PCR反应条件参考文献[4-5]进行。PCR反应体系为12.5 μL，包括10×缓冲液，0.75 μL MgCl2，1 μL dNTP，0.25 μL引物，1.25 U Taq酶以及1 μL DNA模板,其余为双蒸水。PCR反应条件为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s。退火温度55 ℃持续45 s，72 ℃延伸45 s，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物用1．5%的琼脂凝胶电泳5 V/cm共50 min，用溴乙锭染色后在紫外线下成像。引物序列见表1。

表1 PCR扩增引物

1.6PCR产物的基因测序 对OXA-23基因，OXA-51基因，OXA-58基因，ISAba1基因的PCR纯化产物送华大基因公司直接进行基因测序，所测序列与GenBank上已收录的基因序列进行比对以确定其基因型。

2 结 果

2.1菌株临床资料 1 324株鲍曼不动杆菌检出碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌155株(11.71%)，其中ICU 57株，新生儿病房60株，烧伤整形病房13株，呼吸病房10株，共分离非重复的CRAb 155株，其中来自痰液标本136株，分泌物14株，脓液3株，灌洗液1株，导管1株。感染CRAb患儿年龄分布情况：28 d以内(新生儿)46株，28 d到1岁72株，1～2岁10株，2岁以上27株，见表2。

2.2CRAb耐药情况 所有菌株除对多黏菌素敏感性最高，对阿米卡星、环丙沙星、左氧氟沙星、四环素(TE )、复方新诺明 (SXT)、氨苄西林/舒巴坦保持一定敏感性外，对其他耐药率均已达100%。CRAb耐药情况见表3。

表2 155株碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌科室分布情况(株)

表3 155株耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌药敏结果[n(%)]

表4 122株碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌基因型分布情况(株)

2.3测序结果分析 随机选取电泳结果阳性的菌株，PCR产物测序，测序结果见图1。

2.4电泳结果 见图2。

2.5碳青霉烯酶及金属酶的检测 B类碳青霉烯酶基因VIM2、SIM1；D类碳青霉烯酶基因blaOXA-23、blaOXA-24、blaOXA-51、blaOXA-58；扩增blaOXA-23-like、blaOXA-51-like上游ISAba1启动元件检出结果，见表4。

A：blaOXA-23-like基因；B:blaOXA-51-like基因;C:blaOXA-58-like基因；D:ISAba1基因

图1测序结果

A：blaOXA-23-like基因；B:blaOXA-51-like基因;C:blaOXA-58-like基因；D:ISAba1基因

图2电泳结果

3 讨 论

从1985年被发现至今，CRAb的数量在世界范围内迅速增长，这表明鲍曼不动杆菌具有对选择性环境压力作出快速反应的能力[6]。本研究对155株儿童分离CRAb的药物敏感测试结果显示：与文献报道的成人医院分离的CRAb不同[7-12]，儿童分离菌株对阿米卡星、环丙沙星以及左氧氟沙星保持较高的敏感率，并且与国内其他省市儿童医院分离的CRAb不同[13]。本地区儿童分离菌株对四环素、复方新诺明及氨苄西林/舒巴坦保持较高的敏感率，这可能与儿童及成人选药类型的不同而造成的药物选择压力不同有关。不过，与成人分离菌株一致的是，这些菌株对庆大霉素、氨曲南、β-内酰胺酶类抗生素的敏感率均较低。鲍曼不动杆菌抵抗环境改变的主要方式是上调内源性耐药机制及获得外源性耐药基因[7]。尽管鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类的耐药机制与外膜蛋白的改变，外排泵的作用及青霉素结合蛋白亲和力的改变等非β-内酰胺酶类机制也有关，但大量研究表明，碳青霉烯酶的产生是导致鲍曼不动杆菌对此类抗生素耐药最主要的机制[6]。OXA酶是鲍曼不动杆菌中最早被发现的碳青霉烯酶，它为质粒或染色体所编码，是引起全球范围内鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类耐药的主要酶类。国内目前浙江、北京、广州、重庆等地区报道的CRAb产碳青霉烯酶类型均为OXA-23酶。本研究发现：与国内其他地区报道的结果相似，OXA-23酶也是重庆地区鲍曼不动杆菌中最常见的碳青霉烯酶基因型，122株CRAB中，78.69%的细菌均产生OXA-23型碳青霉烯酶，除此之外，OXA-51、OXA-58检出率分别为65.57%、9.8%，并且OXA23/OXA51类基因占57.38%、OXA-23/OXA-51/OXA-58占4.92%。在全球范围内，意大利首先于2006年6月报道在CRAb中发现产OXA-58型鲍曼不动杆菌[14]。同年11月比利时报道发现18株产OXA-58型鲍曼不动杆菌[15]，2011年广州市发现1株OXA-58型鲍曼不动杆菌，因此本地区产OXA-58型CRAb的比例明显高于国内其他地区。本研究在122株耐药菌株中未检出OXA-24、VIM2、SIM1碳青霉烯酶基因，扩增出OXA-51型碳青霉烯酶65.57%，在blaOXA-23-like、blaOXA-24-like上游连接有ISAba1启动元件(88.50%)，OXA-51-like基因天然存在于鲍曼不动杆菌染色体上。TURTON等[16]报道，OXA-51-like酶显示较弱碳青霉烯类水解活性，但是如果其上游存在ISAba1插入序列，该序列可为OXA-51-like提供启动子，促进其大量合成，导致细菌对碳青霉烯类耐药。

综上所述，本院儿童分离CRAb对阿米卡星、环丙沙星及左氟沙星的敏感率显著高于成人,并且对四环素、复方新诺明及氨苄西林/舒巴坦较国内其他省市儿童医院保持一定的敏感率。本地区流行的CRAb产OXA-23、OXA-51、OXA-58型碳青霉烯酶，且以OXA23/OXA51类基因为主，在blaOXA-23-like、blaOXA-51-like上游连接有ISAba1启动元件。SAba1启动元件介导的OXA-23/OXA-51耐药基因的水平传播是导致本地区鲍曼不动杆菌碳青霉烯类耐药性传播的主要途径。