GLOⅠ敲减对AGEs诱导人肾小球系膜细胞氧化应激的影响

徐 莹,李 春,操 轩

(湖北理工学院附属医院/湖北省黄石市中心医院肾内科 435000)

糖尿病肾病(diabetes nephrosis，DN)是由糖尿病引起的肾脏损害，是糖尿病患者死亡的主要原因之一。DN的发病机制非常复杂，涉及的因素也很多，目前研究发现代谢紊乱、肾素-血管紧张素-醛固酮系统的异常激活和氧化应激等均与DN的发生、发展有一定关系。氧化应激与DN关系极为密切，高浓度的葡萄糖可引起氧化应激[1]；同时，过量的糖可与长寿命的蛋白质(如胶原)结合，形成稳定的晚期糖基化终末产物(advanced glycationend products，AGEs)，AGEs随之可引起氧化应激[2]。肾小球系膜细胞(renal mesangial cells，RMCs)是肾小球的固有细胞之一，可控制肾小球血流，并对肾小球毛细血管起支架和保护作用。糖尿病时，AGEs的加速形成和累积可促进肾小球系膜细胞的氧化应激损伤，随后肾小球系膜扩张，发生肾小球硬化，逐渐演变为DN[3-4]。

乙二醛酶Ⅰ( glyoxalase Ⅰ，GLOⅠ)是人体内主要的α羰基醛解毒酶，其主要作用为催化甲基乙二醛(MG)转化为乳酸，从而减少AGEs生成，起到对AGEs的解毒作用。GLOⅠ与糖尿病的视网膜损伤、大血管损伤和周围神经病变等有关[5-7]。但目前关于GLOⅠ在DN中的具体作用及分子机制的研究并不深入。基于此，本文首先检测了DN患者尿液中GLOⅠ水平的变化，随后分析GLOⅠ敲减对AGEs所诱导的人肾小球系膜细胞(human renal mesangial cells，HRMCs)氧化应激的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1材料 人肾小球系膜细胞HRMCs购自美国Scien Cell研究实验室，培养于DMEM培养基[含10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和100 μg /mL链霉素]；FBS购自以色列BI公司；AGEs购自英国Abcam公司；RNA提取试剂Trizol和转染试剂脂质体Lipofectamine 2000购自美国Thermo Fisher公司；H2DCFDA试剂盒购自上海碧云天公司；P22phox和GAPDH引物购自上海生工生物工程股份有限公司；定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction，Q-PCR)试剂盒购自日本Takara公司；总p38抗体、磷酸化p38(p-p38)抗体、总AKT抗体、AKT 308位苏氨酸磷酸化(308Thr)抗体，AKT 473位丝氨酸磷酸化(473Ser)抗体、内参β-actin抗体、HPR标记的二抗均购自美国CST公司；P22phox抗体购自英国Abcam公司；GLOⅠ小干扰RNA(siRNA)序列由江苏库美生物设计合成；ECL化学发光试剂购自美国Pierce公司。

1.2尿液标本收集 参与研究的2型糖尿病患者选自湖北省黄石市中心医院住院患者，在收集尿样之前患者均已知情同意。样本分类根据糖尿病患者的临床特征，共分为4个研究亚组：C组(对照组)为无糖尿病的健康个体，共35例；DM组为无糖尿病肾病的2型糖尿病患者，共34例，其尿清蛋白/肌酐比值(ACR)<30 mg/g；DN low组为有微量蛋白尿(ACR 30～300 mg/g)的2型糖尿病肾病患者，共18例； DN high组为有大量蛋白尿(ACR>300 mg/g)的2型糖尿病肾病患者，共22例。

1.3尿液GLOⅠ水平检测 GLOⅠ水平采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法(德国默克)测定，检测仪器为美国Biorad公司iMARK 680 酶标仪。

1.4脂质体转染 接种HRMCs于24孔板或6孔板中，无双抗培养基培养，待细胞密度达70%左右，弃去培养基，每孔加入无血清无双抗培养基200 μL或500 μL，37 ℃孵育30 min。24孔板每孔加入5 μg siRNA、5 μL Lipofectamine 2000和90 μL无血清无双抗培养基，6孔板每孔加入15 μg siRNA、15 μL Lipofectamine 2000和470 μL无血清无双抗培养基，37 ℃孵育5 h后更换为完全培养基，经相应处理后进行后续检测。

1.5ROS活性检测(H2DCFDA荧光探针标记法) HRMCs接种于96孔板内，不同处理因素处理8 h后，弃去细胞上清液，加入200 μL H2DCFDA探针(浓度为10 μmol /L)，37 ℃避光环境下继续孵育20 min，荧光显微镜下检测细胞内ROS变化并成像记录。

1.6Q-PCR Trizol法提取细胞总RNA，经逆转录合成cDNA。随后以cDNA 为模板进行Q-PCR扩增反应，反应体系为10 μL：上、下游引物各0.4 μL、ddH2O 3.2 μL、SYBR Green 5.0 μL、cDNA 1.0 μL。反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 20 s，66 ℃ 10 s，3次循环；95 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，70 ℃ 1 s，39次循环，延伸末尾采集荧光；65～95 ℃熔解曲线分析，计算目的基因表达水平。

1.7Western blot HRMCs经不同处理因素处理48 h后，蛋白裂解液裂解细胞，提取总蛋白，经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后，电转移至聚二偏氟乙烯(PVDF)膜上，在含5%牛血清清蛋白(BSA)的TBST中封闭1 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，加入相应HPR标记的二抗，37 ℃孵育1 h，最后进行ECL显影分析。

2 结 果

2.1GLOⅠ检测 经ELISA检测，与C组比较，DM组、DN low组、DN high组患者尿液中GLOⅠ水平逐渐下降，其差异有统计学意义(图1)。

**：P<0.01，*：P<0.05

图1 4组人群尿液GLOⅠ水平检测(ELISA)

2.2利用siRNA对HRMCs中GLOⅠ进行有效敲减 为了分析和确认GLOⅠ在DN中的作用，笔者选取肾小球系膜细胞HRMCs，设计了3条针对GLOⅠ的siRNA(分别命名为siGLOⅠ-1、 siGLOⅠ-2和siGLOⅠ-3)，根据转染的siRNA将细胞分为：Blank组(未作任何处理)、NC组(转染无意义siRNA)、siGLO-1组(转染siGLOⅠ-1)、siGLO-2组(转染siGLOⅠ-2)、siGLO-3组(转染siGLOⅠ-3)。结果发现：3条siRNA均可实现对HRMCs中GLOⅠ的敲减，其中以siGLOⅠ-3的敲减效果最为明显(图2)。因此，后续实验均选用siGLOⅠ-3。

图2 Westen blot验证siRNA对GLOⅠ敲除效果

2.3GLOⅠ敲减可进一步增强AGEs所诱导的HRMCs细胞内ROS活性 H2DCFDA 荧光探针标记检测发现：与Blank组比较，200 μg/mL的AGEs(AGEs组)可导致HRMCs细胞氧化应激增加，HRMCs细胞内ROS活性上升。而与AGEs组比较，GOLⅠ(AGE+siGOLⅠ3)则可进一步增强由AGEs所诱导的HRMCs细胞内ROS活性(图3)。

图3 GLOⅠ敲减对HRMCs细胞内ROS活性的影响

2.4GLOⅠ敲减可促进AGEs所诱导的P22phox表达 Q-PCR和Western blot检测均发现：与Blank组比较，200 μg/mL的AGEs(AGEs组)可诱导P22phox的表达，而GLOⅠ敲减(AGE+siGOLⅠ3组)可使AGEs所诱导的P22phox mRNA和蛋白表达均进一步增加(图4)。结合ROS活性检测结果可知，GLOⅠ敲减可促进AGEs所诱导的HRMCs细胞氧化应激。

A：GLOⅠ敲减对AGEs作用下细胞P22phox mRNA表达的影响(Q-PCR，**：P<0.01)；B：GLOⅠ敲减对AGEs作用下细胞P22phox蛋白表达的影响(Western blot)

图4 GLOⅠ敲减对AGEs作用下HRMCs细胞P22phox的影响

图5 GLOⅠ敲减对AGEs诱导的AKT信号和p38信号蛋白的影响

2.5GLOⅠ敲减可促进AGEs所诱导的PI3K/AKT信号和p38信号蛋白的活化 本研究利用Western blot检测了GLOⅠ敲减对AGEs诱导的PI3K/AKT信号和p38信号的影响，结果发现：与AGEs组比较，GLOⅠ敲减可使AGEs诱导的AKT磷酸化和p38磷酸化进一步增加(图5)。

3 讨 论

氧化应激是指机体在内源性或外源性有害因素的刺激下，体内高活性分子如ROS等产生过多，体内的抗氧化和氧化两大系统平衡失调，机体更加倾向于氧化，并最终导致组织及细胞损伤。氧化应激使机体处于高度易损状态，持续的氧化应激与多种疾病如高血压、溃疡性结肠炎、脑缺血再灌注损伤、阿尔海默茨症、肿瘤等密切相关[8-13]。氧化应激在DN的发生、发展中也起着重要作用，葡萄糖本身可诱发氧化应激，葡萄糖与长寿命的蛋白质结合所形成的晚期糖基化终末产物(AGEs)也是诱发氧化应激的重要因素。当血糖正常时，AGEs形成非常缓慢。在长期的高血糖糖化反应的作用下，引起原本形成非常缓慢的AGEs 的加速形成和累积。AGEs与糖尿病慢性并发症有关，也与其他疾病如衰老、老年痴呆等有相关性[14-15]。AGEs水平的上升也会导致肾小球系膜细胞的氧化应激，引起肾小球正常滤过功能的缺失，最终导致糖尿病肾病的发生、发展[3-4]。

GLOⅠ作为甲基乙二醛(methylglyoxal，MG)最重要的降解酶之一，可降低作为非酶糖化反应中间体MG的含量，从而减少非酶糖化蛋白如AGEs的生成，可保护机体免受AGEs所致的慢性损伤。研究证实，在人血管内皮细胞中过表达GLOⅠ可逆转高糖所诱导血管生成减少和AGEs的累积[16]，GLOⅠ对高糖所致的神经损伤也具有保护作用[17]。在GLOⅠ转基因大鼠中，GLOⅠ对高糖诱导的肾脏损伤有明显保护作用，大鼠的各种肾损伤指标均明显降低[18]。反之，在非糖尿病大鼠中敲除GLOⅠ基因后，会使大鼠肾脏表现出与DN相似的病理表现[19]，由此提示GLOⅠ表达水平的改变与DN的发生密切相关。本研究则进一步表明：GLOⅠ在DN患者尿液中含量降低，同时在人肾小球系膜细胞HRMCs中，GLOⅠ敲减会增加AGEs作用下的细胞氧化应激，在机制研究中，则证明PI3K/AKT和p38信号途径与之相关，因此，GLOⅠ的确可能是与DN相关的重要分子。

总之，本研究表明GLOⅠ的降低可以引起肾小球系膜细胞HRMCs的氧化应激，这可能是导致DN发生的关键原因之一。GLOⅠ可作为DN发生和治疗的潜在新靶点，用于DN的早期诊断和病情评估，但目前对于GLOⅠ在DN中具体作用并未完全明确。虽然本研究证实了GLOⅠ可影响PI3K/AKT信号和p38信号蛋白，但是GLOⅠ导致HRMCs细胞氧化应激的机制远远没有阐明，后续将进一步分析DN患者血液和尿液GLOⅠ的变化，并探讨GLOⅠ与其他信号蛋白ERK1/2等的关系，以便为深入解析GLOⅠ在DN中的作用奠定基础。