微波协同L-phe处理对萌发苦荞中主要营养成分的影响

马 辉，卞紫秀，陈雪怡，储 钰，王顺民

(安徽工程大学 生物与化学工程学院，安徽 芜湖 241000)

苦荞麦(FagopyrumtataricumGaertn.)富含芦丁和槲皮素等黄酮类化合物[1]，具有很好的抗氧化、抗炎症和抗癌症等作用[2-4]，是一种药食两用的重要作物。长期食用苦荞对软化血管、降血糖、降血脂、降血压和增强人体免疫力具有积极作用[5-6]。近年来，大量研究表明，采用微波[7]、激光[8]、超声波[9]和磁场[10]等物理方法处理种子能够对其萌发过程产生一定的诱导效应和生物效应。微波是一种电磁波，对种子进行辐照能够产生大量的热量[11]，使种子内部蛋白质和淀粉的分子结构改变[12]，从而影响种子在萌发过程中的生理生化性状。Maqueda[13]和Audrius[14]的研究证实，微波能够提高植物种子的萌发率与芽苗的活力。除此之外，适当的微波辐照还能够显著增加游离氨基酸、还原糖、总酚及总黄酮的积累量[7,15]。因此，微波辐照对增加苦荞种子、芽苗的活力与芽苗中营养成分的富集具有重要意义。

苯丙氨酸(Phenylalanine，Phe)属于芳香族氨基酸，是植物生长发育所必需的氨基酸之一。作为苯丙烷代谢的前体物质，连接着初级代谢和苯丙烷类次级代谢，对植物的初级代谢及苯丙烷代谢起着重要作用[16]。研究表明，使用适量的外源Phe处理能够刺激苦荞芽苗中碳水化合物、总酚[17]和黄酮类物质[18]的积累量的增加。Ozturk[19]采用HPLC分析表明，添加外源L-phe能够诱导没食子酸、反式肉桂酸、对香豆酸、阿魏酸等酚类化合物的积累量显著增加。Seo[20]证实，5 mM的外源L-phe处理对酚类化合物积累的促进效应最佳，同时，苯丙烷类代谢途径中CHI和FLS两种酶的基因表达量也显著增加。Md-Mustafa[21]表明，外源Phe处理下，总酚和总黄酮积累量的增加是由于刺激了苯丙烷类代谢途径中苯丙氨酸解氨酶和查尔酮合成酶基因的表达。因此，通过添加适量L-phe来调控苦荞萌发过程中多种营养成分的合成是一种科学有效的方法。

目前关于采用微波和外源Phe分别处理种子萌发的研究较多，而关于微波协同外源Phe处理对苦荞萌发过程中营养成分变化的研究尚未见报道。实验研究不同微波处理对苦荞麦种子萌发率的影响，在萌发率实验的基础上，研究微波条件协同不同摩尔浓度的外源L-phe处理对苦荞麦种子在萌发过程中总酚、总黄酮、还原糖及可溶性总糖含量的影响，为进一步探究苦荞麦萌发过程中营养成分变化规律及深入开发利用苦荞提供一定理论基础。

1 实验材料与方法

1.1 材料与设备

苦荞麦(购自四川凉山);L-phe、芦丁、Al(NO3)3、硫代巴比妥酸、3,5-二硝基水杨酸均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。

光照种子发芽箱(YRG-150，上海台恒仪器设备有限公司)；风力悬浮微波炉(P7021TP-6，安徽工程大学食品系-芜湖众维教研仪器研发公司联合开发)；医用离心机(TGL-16A，长沙平凡仪器仪表有限公司)；真空冷冻干燥机(LGJ-12，北京松源华兴科技发展有限公司)。

1.2 处理及培养

选取颗粒饱满的苦荞种子，1 g/L KMnO4消毒5 min，室温下使用蒸馏水浸泡4 h(每2 h换水一次)，后置于55 ℃水浴中催芽15 min。催芽结束使种子冷却至室温，再按照下述方法进行处理。

(1)微波处理对萌发率的影响：分别采用400 W 10 s、400 W 30 s、600 W 10 s和600 W 30 s的微波条件处理苦荞种子。以蒸馏水为培养液，将苦荞种子置于光照培养箱(设置温度为25 ℃，湿度为80%)内避光培养，每12 h测定各组苦荞种子的萌发率。

(2)L-phe处理对苦荞种子的影响：以蒸馏水作为培养液，将苦荞种子置于光照培养箱内避光培养至露白(1.5 d)后，分别采用1 mM、3 mM、5 mM、7 mM和9 mM的L-phe对苦荞种子进行培养。

(3)微波协同L-phe处理对苦荞种子的影响：采用微波(在萌发率实验的基础上)预先处理苦荞种子，然后以蒸馏水作为培养液，将苦荞种子置于光照培养箱培养至露白后，采用不同摩尔浓度的L-phe培养苦荞种子。

从苦荞种子露白后开始，培养至第7 d，每12 h换1次新鲜培养液。采收发芽1 d、3 d、5 d和7 d的长势均匀的苦荞芽苗，冷冻干燥后备用。以未经微波与L-phe处理的种子作为对照组，每个水平做3次重复。

1.3 总酚含量的测定(Folin-Phenol比色法)

称取0.2 g苦荞于研钵中，加入石英砂磨粉。每组的样品冻干粉中加入5 mL 60%乙醇溶液，在超声波中水浴浸提30 min(60 ℃)后，于8 000 r/min离心10 min，取上清液至10 mL容量瓶并定容至刻度，备用。参照Ling[22]的方法，在765 nm波长处测定吸光度并根据没食子酸标准曲线计算总酚含量。

1.4 总黄酮含量的测定(硝酸铝显色法)

称取0.2 g苦荞干样于研钵中粉碎，加入5 mL 60%乙醇溶液，置于超声波中水浴浸提30 min(60 ℃)后，于9 000 r/min离心15 min，取上清液至10 mL容量瓶并定容至刻度，备用。参照Ling[22]的方法，在502 nm下测定吸光度并根据芦丁标准曲线计算总黄酮的含量。

1.5 还原糖含量的测定(DNS法)

采用高俊凤[23]的方法制备粗糖上清液。取2 mL上清液(剩余上清液用作可溶性总糖含量的测定)于试管中，加入2 mL 3，5-二硝基水杨酸试剂，在沸水浴中准确反应5 min后，立即用流水冷却至室温，最终移液至25 mL容量瓶中并定容至刻度，摇匀后于540 nm下测定吸光度并根据葡萄糖标准曲线计算还原糖的含量。

1.6 可溶性总糖含量的测定(蒽酮-H2SO4法)

采用高俊凤[23]的方法：取1.5中测定还原糖剩余的上清液1 mL，置于10 mL容量瓶中并定容，取2 mL至试管中，在冰水浴下沿管壁缓慢加入蒽酮-H2SO4试剂，摇匀后置于沸水浴中准确加热10 min，待反应结束后立即用流水冷却至室温，在波长620 nm处测定吸光值并根据葡萄糖标准曲线计算可溶性总糖的含量。

1.7 数据处理

试验数据是将3次重复的结果以平均值±标准差表示，采用SPSS 18.0统计分析软件对其进行One-way方差分析(ANOVA)，采用SigmaPlot 10.0进行绘图。

2 结果与分析

2.1 微波处理对苦荞麦种子萌发率的影响

不同微波处理下苦荞种子萌发率的变化如图1所示。由图1可知，随着萌发时间的增加，苦荞种子的萌发率在24～48 h快速增加，待萌发至72 h后，所有处理组和对照组的萌发率均趋于稳定。萌发24 h，400 W 10 s的微波处理组的萌发率最高达11.67%，相比对照组增加了52.15%。随着萌发时间的增加(24～60 h)，400 W 10 s的微波处理组的萌发率均高于其他处理组与对照组，当萌发至108 h，该处理组的萌发率达到95.33%，与所有处理组及对照组无明显差异。结果表明，400 W的微波功率处理10 s能够明显提高苦荞种子在萌发初期的萌发率(微波协同L-phe的处理步骤中均采用400 W 10 s的微波条件进行处理)，而对种子的最终萌发率影响没有统计学差异。

图1 不同微波处理下苦荞种子萌发率的变化

2.2 微波协同不同摩尔浓度的L-phe处理对萌发苦荞中总酚含量的影响

微波协同L-phe处理下萌发苦荞中总酚含量的变化如图2所示。由图2可知，萌发1～3 d内，随着萌发时间的增加芽苗中总酚含量逐渐增加，萌发5 d时，芽苗中总酚含量最高，而当萌发至第7 d时，总酚含量有所下降。在萌发5 d的芽苗中总酚含量变化规律表现为随着L-phe摩尔浓度的增加呈现先增加后降低的趋势，当L-phe的摩尔浓度为5 mM时，芽苗中总酚含量最高达23.11 mg/g，相比对照组增加了16.95%。当采用微波处理(400 W 10 s)协同L-phe(5 mM)处理时，萌发5 d的芽苗中总酚含量相对L-phe处理(5 mM)降低了3.68%，而萌发7 d的芽苗中总酚含量继续增加达23.33 mg/g，相比对照组增加了38.37%，得到萌发7 d内最高的总酚积累量。结果说明，采用适当的苯丙烷类代谢前体物质[16]L-phe处理(1～7 mM)能够明显提高苦荞种子萌发过程中总酚的积累量，且在微波(400 W 10 s)与L-phe(5 mM)的协同处理下，能够获得更高的总酚积累量，这可能与苯丙烷类代谢途径中CHI和FLS两种酶基因表达量的增加密切相关[20]。

图2 微波协同L-phe处理下萌发苦荞中总酚含量的变化

2.3 微波协同不同摩尔浓度的L-phe处理对萌发苦荞中总黄酮含量的影响

微波协同L-phe处理下萌发苦荞中总黄酮含量的变化如图3所示。由图3可知，随着萌发时间的增加，苦荞芽苗中总黄酮含量逐渐增加。当采用不同摩尔浓度的L-phe处理时，芽苗中总黄酮含量随着L-phe摩尔浓度的增加呈现先增加后降低的趋势。其中，7 mM L-phe处理下萌发7 d的苦荞芽苗中总黄酮的积累量最高达4.84 g/100 g，相比对照组增加了28.38%。而当采用微波协同L-phe处理(5 mM)时，萌发7 d的芽苗中总黄酮的积累量达到5.10 g/100 g，相比对照组及L-phe处理组(5 mM)分别增加了35.28%和5.37%。结果说明，一定摩尔浓度的L-phe处理(1～7 mM)对苦荞种子中总黄酮的积累具有促进效应，且一定微波处理(400 W 10 s)协同一定摩尔浓度的L-phe处理(5 mM)对总黄酮积累的促进效应更佳。

图3 微波协同L-phe处理下萌发苦荞中总黄酮含量的变化

2.4 微波协同不同摩尔浓度的L-phe处理对萌发苦荞中还原糖含量的影响

微波协同L-phe处理下萌发苦荞中还原糖含量的变化如图4所示。由图4可知，苦荞芽苗中还原糖含量随着萌发时间的增加而不断增加，当萌发至5 d时，还原糖含量开始出现下降的趋势。在L-phe处理的萌发5 d的芽苗中，采用5 mM L-phe处理的芽苗中还原糖含量达5.20 g/100 g，明显高于其他摩尔浓度的L-phe处理组及对照组。当采用微波处理(400 W 10 s)协同L-phe处理(1～7 mM)时，5 d的芽苗中还原糖含量相比单独采用L-phe处理的芽苗明显增加。有趣的是，在微波协同L-phe处理下，7 d的芽苗中还原糖含量相比第5 d继续增加，当L-phe的摩尔浓度为5 mM时，芽苗中还原糖含量最高达6.56 g/100 g，相比对照组增加了59.61%，这可能与微波辐照改变了淀粉的分子结构而加速其向小分子碳水化合物转化密切相关[12]。结果说明，一定摩尔浓度的L-phe处理(1～5 mM)能够有效促进苦荞芽苗中还原糖含量的增加，而采用一定条件的微波刺激(400 W 10 s)后再使用一定摩尔浓度的L-phe处理(1～7 mM)能够更好地促进苦荞芽苗中还原糖含量的增加。

图4 微波协同L-phe处理下萌发苦荞中还原糖含量的变化

2.5 微波协同不同摩尔浓度的L-phe处理对萌发苦荞中可溶性总糖含量的影响

微波协同L-phe处理下萌发苦荞中可溶性总糖含量的变化如图5所示。由图5可知，萌发1～5 d内，苦荞芽苗中可溶性总糖含量随着萌发时间的增加不断增加，而萌发5～7 d内，其含量增加速度缓慢。在萌发7 d的芽苗中，L-phe处理(1～7 mM)对可溶性总糖的积累表现出了一定的促进效应，且随着其摩尔浓度的增加可溶性总糖含量呈现先增加后降低的趋势，其中，5 mM的L-phe处理的芽苗中可溶性总糖含量最高达13.07 g/100 g，比对照组增加了10.86%。由图5a、图5b、图5c和图5d中均可看出，经微波预先处理的苦荞种子在萌发过程中可溶性总糖含量相比未经微波处理有明显的增加趋势。当采用微波协同5 mM的L-phe处理时，7 d的芽苗中可溶性总糖最高达15.11 g/100 g，比对照组和L-phe处理组(5 mM)分别增加了28.16%和15.61%。结果说明，微波处理(400 W 10 s)和L-phe处理(1～7 mM)对苦荞芽苗中的可溶性总糖含量的增加均具有一定促进效应，且微波(400 W 10 s)协同L-phe处理(1～9 mM)对芽苗中可溶性总糖含量积累的促进效应更佳。

图5 微波协同L-phe处理下萌发苦荞中可溶性总糖含量的变化

3 结论

实验前期研究了微波功率对苦荞种子萌发率的影响，结果表明，采用400 W的微波功率处理10 s能够有效提高苦荞种子在萌发初期的萌发率。Wang[7]的研究表明，600 W的微波功率辐射10 s对苦荞种子的萌发率提升最高，与本实验结果存在不同之处是由于选用的苦荞种子的产地有所差异。采用400 W 10 s的微波条件协同不同摩尔浓度的L-phe处理，研究了苦荞种子萌发过程中主要成分的变化规律，结果表明：微波处理(400 W 10 s)能够提高萌发苦荞中总酚、还原糖和可溶性总糖的含量。一定L-phe处理(1～7 mM)能够提高萌发苦荞中总酚、总黄酮的积累量；一定L-phe处理(1～5 mM)能够提高萌发苦荞中还原糖和可溶性总糖的含量。微波(400 W 10 s)协同一定L-phe处理(5 mM)对萌发苦荞中总酚、总黄酮、还原糖和可溶性总糖含量的积累具有较好的促进效应，在此条件下萌发7 d的苦荞芽苗中4种成分的含量达到最高。研究为苦荞麦萌发过程中营养成分富集方面的研究及深入开发利用苦荞提供了一定理论基础。