雄激素受体、肿瘤抑制蛋白P53在三阴性乳腺癌中的表达及其与预后的关系

刘现义，李 中，王晓春，史鸿云，游冀鹏

(河北大学附属医院乳腺外科 071000)

三阴性乳腺癌(TNBC)指人类表皮生长因子受体(HER-2)、雌激素受体(ER)及孕激素受体(PR)均呈阴性的乳腺癌[1]。TNBC具有癌组织细胞分化程度较低、组织学分级较高等特点，且对分子靶向治疗不敏感，难以建立有效治疗方案，导致TNBC复发率和病死率较高[2]。雄激素受体(AR)属类固醇激素受体，对细胞增殖信号传导通路具有调节作用。肿瘤抑制蛋白p53(P53)是一种蛋白质，由抑癌基因表达产生，具有抑制DNA复制及细胞恶性增殖等作用。有研究[3-4]指出TNBC患者预后与AR、P53表达情况关系密切。本研究采取回顾性分析，以2013年1月至2014年1月于本院接受治疗的乳腺癌患者临床资料为研究对象，探讨AR、P53在TNBC中的表达情况及其与患者预后的相关性。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2011年1月至2014年1月于本院接受治疗的130例乳腺癌患者，其中手术病理确诊TNBC患者32例(TNBC组)，另选取同期于本院手术病理确诊的32例非三阴性乳腺癌(NTNBC)患者作对照(NTNBC组)。本研究经本院医学伦理委员会审查同意。纳入标准：(1)经免疫组织化学检测证实HER-2、ER及PR均呈阴性；(2)就诊时远处脏器无转移；(3)未接受新辅助化疗，均接受手术治疗；(4)临床资料完整，包括基线资料、病理诊断、治疗方式等；(5)随访资料完整，包括转移时间及部位、死亡事件等；(6)患者均自愿且签署知情同意书。排除标准：(1)合并严重感染性疾病或呼吸、血液、肝肾等原发性疾病者；(2)临床资料或随访资料不全者。

1.2检测方法 于手术中收集患者癌组织标本，置于10%甲醛中固定并制作石蜡包埋块。(1)AR：①将所有患者的石蜡包埋块进行切片，每张切片厚4 μm；②将切片置入60 ℃烤箱内120 min进行脱腊；③用pH=6.0柠檬酸盐缓冲液对切片进行抗原修复；④于0.3%过氧化氢(H2O2)溶液中浸泡10 min以阻断内源化H2O2酶的活性；⑤10%正常血清进行封闭，室温中孵育10 min；⑥滴加AR多克隆抗体，置于4 ℃孵育过夜；⑦滴加生物素标记二抗，37 ℃孵育20 min；⑧滴加辣根酶标记链霉素三抗，37 ℃孵育20 min，行二氨基联苯胺(DAB)染色。(2)P53：①切片、脱蜡及水化流程同AR检测；②于柠檬酸溶液中煮沸8 min，保温10 min；③冷却后，滴加鼠抗人P53单克隆抗体(上海宾智慧生物)，置于5 ℃孵育；④滴加生物素标记二抗，37 ℃孵育20 min，行DAB染色。

1.3阳性判定标准 显微镜下观察：(1)细胞核染色细胞数大于10%判定为AR阳性[5]；(2)癌细胞核呈现棕黄色颗粒判定为阳性细胞，阳性细胞大于10%判定为P53阳性[6]。

1.4随访 随访时间自手术日期开始，至2017年1月为止。无病生存(DFS)率=随访期间内未出现疾病相关性事件(包括转移、复发或死亡)人数/总人数×100%；总生存(OS)率=随访期间内未发生死亡事件人数/总人数×100%。随访方式包括定期复查、电话及信访。

2 结 果

2.1临床病理特征 与NTNBC组比较，TNBC组中组织学1级占比明显更低(χ2=4.947，P<0.05)、组织学3级占比明显更高(χ2=4.433，P<0.05)。两组年龄、绝经状态、TNM分期、肿瘤直径、淋巴结转移率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2AR、P53在TNBC和NTNBC患者中的表达 TNBC组中AR阳性表达率较NTNBC组明显降低(P<0.05)；P53阳性表达率明显高于NTNBC组(P<0.05)。见表2。

2.3AR、P53表达与TNBC临床病理特征关系 与组织学1～2级者比较，TNBC组中组织学3级者AR阳性表达率明显下降(P<0.05)，P53阳性表达率明显升高(P<0.05)。与TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期者比较，TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期者AR阳性表达率明显降低(P<0.05)，P53阳性表达率达明显增加(P<0.05)。有淋巴结转移者AR阳性表达率明显低于无淋巴结转移者(P<0.05)，但P53表达与TNBC患者淋巴转移状态无明显相关(P>0.05)。肿瘤直径大于或等于2 cm者P53阳性表达率较肿瘤直径小于2 cm者明显升高(P<0.05)，但AR表达与TNBC患者肿瘤直径无明显相关(P>0.05)。AR和P53表达与患者年龄、绝经状态均无明显关系(P>0.05)。见表3。

2.4AR、P53表达与TNBC患者预后的关系 TNBC患者中随访时间最短4个月，最长36个月，中位时间27个月。其中复发8例，DFS最短为2个月，最长为36个月。AR阳性表达者3年DFS率、OS率均高于AR阴性者，3年复发率低于AR阴性者，但差异均无统计学意义(P>0.05)。P53阳性表达者3年DFS率、OS率均明显低于P53阴性者，3年复发率明显高于P53阴性者，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表1 两组临床特征参数比较[n(%)]

表2 AR、P53在TNBC和NTNBC患者中表达情况比较[n(%)]

表3 AR、P53表达与TNBC临床病理特征关系[n(%)]

表4 AR、P53表达与TNBC患者预后的关系[n(%)]

3 讨 论

乳腺癌为女性多发恶性肿瘤之一，其病死率位居女性癌症之首。近年来乳腺癌发病率正以每年4%的速度快速增长，已严重危害女性健康。TNBC约占乳腺癌的20%，具有侵袭性强、累及淋巴多、常出现远处转移、恶性程度高、复发率高、预后差等特点[7]。TNBC对分子靶向或内分泌治疗不敏感，目前临床治疗以化疗为主，但未取得满意疗效；还有学者针对抗血管生成抑制剂等肿瘤细胞标志物探究新的治疗手段，但其有效性尚未得到充分验证[8]。本研究通过分析AR与P53在TNBC中的表达及其与患者预后的关系，旨在探究AR和P53在TNBC病理生理中的作用机制，以期为TNBC治疗提供新靶点。

AR与ER、PR均属类固醇激素受体，其中ER和PR既为TNBC判定指标，也是内分泌治疗的选择标准；但现代医学对AR在TNBC病理发展中的作用机制尚未完全阐明，也未形成相应的靶向治疗方案。AR由N端转录激活区、铰链区、配体结合区和DNA结合区4个结构域构成，可通过调节细胞周期蛋白等参与细胞增殖及分化。正常状态下AR在细胞质中呈稳定状态，当AR与雄激素结合时构象发生改变、调控靶基因转录，在乳腺上皮细胞及普通细胞中均有表达，体现出乳腺上皮细胞具有雄激素应答性[9]。刘晓丽等[10]报道称AR在乳腺癌中表达率高达80%左右，属表达最广泛的类固醇激素受体，其在NTNBC中表达率大于70%，在TNBC中表达率为10%～45%。本研究显示TNBC组中AR阳性表达率为46.88%，明显低于NTNBC组(81.25%)，这与蒋威华等[11]研究结果相似；说明TNBC患者AR表达缺失与乳腺癌恶性表型密切相关。同时本研究中AR阳性表达与TNBC患者年龄、绝经状态和肿瘤直径均无明显相关性，而与组织学分级、TNM分期、淋巴结转移均明显相关；表现为TNBC患者中组织学3级、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移者AR阳性表达率较组织学1～2级、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移者均明显降低；提示AR阳性表达的TNBC患者癌细胞增殖活力弱，但分化程度高。且AR阳性表达者的淋巴结转移率较低，说明AR阳性者不易发生淋巴结转移，这与相关研究[12]结果一致。究其原因可能为AR可对癌细胞增殖起到一定抑制作用，从而有效阻止乳腺原位癌转变为浸润性癌。此外本研究显示TNBC患者中AR阳性表达者3年DFS、OS率，3年复发率与AR阴性者差异无统计学意义(P>0.05)，而文献[13]报道AR阳性表达的TNBC患者3年DFS、OS率均显著优于阴性表达者(P=0.047、0.041)。分析原因可能与本研究选取的样本量相对较少有关。1项Meta分析[14]显示AR阳性表达者DFS及OS较高，AR可作为早期乳腺癌患者的预后标志物。同时雷雨等[15]报道亦称对TNBC患者而言AR阴性可预测不良预后，原因可能为AR表达缺失可促进TNBC患者癌细胞发生分级，从而诱发远处转移的发生及癌细胞复发，而复发及转移为乳腺癌致死的重要诱因。

P53蛋白是由位于17号染色体短臂上的p53基因表达产生，该基因包括10个内含子和11个外显子，是目前发现的与肿瘤关系最紧密的基因，参与了细胞分化、凋亡、衰老及DNA损伤修复等重要过程[16]。p53基因包括野生型和突变型，其中野生型p53基因产生的P53蛋白可保护DNA免受药物或射线袭击，还可起到DNA损伤修复作用；同时可对处于G期的细胞起关键调节作用，具体表现为抑制恶性增殖，促使癌变细胞凋亡，维持正常分化。但野生型P53蛋白半衰期较短，难以通过免疫组织化学方法检测。免疫组织化学方法检测到的均为半衰期较长的突变型P53蛋白。p53基因突变率20%～50%，突变后P53蛋白则失去阻止癌细胞增殖的作用，突变型P53蛋白可抑制野生型P53蛋白，引起细胞恶变、转化或凋亡，并诱发异常有丝分裂，促进恶性肿瘤发生。有研究[17]显示突变型p53基因过度表达常标志癌基因的不断扩增，50%～70%乳腺癌患者可出现p53基因突变。本研究显示TNBC组中P53阳性表达率为71.88%，明显高于NTNBC组(43.75%)，与杨艳芳等[18]研究一致；说明TNBC患者癌细胞增殖活性更强，但分化能力差。另外本研究中P53表达与TNBC患者年龄、绝经状态、淋巴结转移均无明显相关性，而与组织学分级、TNM分期、肿瘤直径相关；且组织学3级、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、肿瘤直径大于或等于2 cm者P53阳性表达率较组织学1～2级、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、肿瘤直径小于2 cm者均明显降低，这与黄硕等[19]报道类似，提示TNBC患者P53阳性表达时癌细胞分化程度低、增殖活力强、侵袭性强，同时也说明P53可能参与了TNBC的转移及复发。本研究还发现中P53阳性表达者3年DFS率、OS率均明显低于P53阴性表达者，3年复发率明显高于P53阴性者，说明P53阳性表达的TNBC患者更易出现转移、复发。有研究[20]报道称可将P53作为TNBC患者预测复发及生存的评判因子。雷珍等[21]研究亦显示P53贯穿TNBC病理发展的始终，并可将其作为预后评估的重要指标。

综上所述，TNBC患者中AR阳性表达越高、P53阳性表达越低，预后较好，AR和P53均参与了TNBC病理过程，可作为其预后评估指标。但对于AR及P53在TNBC病情进展中的具体作用机制，仍有待临床更多研究进一步论证与分析。