洛伐他汀对同型半胱氨酸硫内酯诱导的HUVECs中IL-1和IL-6的表达影响分析

黄宁江（通讯作者） 黄仕芳 姜卓 胡昊良 徐婵

（1永州职业技术学院 湖南 永州 425000）

（2永州市第一人民医院 湖南 永州 425000）

（3湖南师范大学生命科学学院 湖南 长沙 41081）

高同型半胱氨酸血症（Hyperhomocysteinemia，HHcy）是导致心脑血管疾病的独立危险因素之一[1-2]。目前认为HHcy与动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）、血栓性疾病密切相关，但是HHcy导致AS的发病机制目前尚不清楚。研究发现，HHcy致病的病理学基础主要与同型半胱氨酸（homocysteinemia，Hcy）在体内转变成同型半胱氨酸硫内酯（homocysteine thiolactone，HTL）有关[3]，HTL能导致血管损伤，但具体机制尚未明确。他汀类药物是临床常用治疗高胆固醇血症的药物，除了有调血脂的作用外，还具有改善内皮功能[4]、抗血管炎症等非调脂性作用。文献报道，他汀类对HHcy引起的血管内皮功能损伤有保护作用。洛伐他汀（lovastatin，LVT）是临床用于治疗高胆固醇血症的他汀类药物之一，本课题组在前期实验中发现LVT可显著减轻HTL对EDR的抑制作用，减少血管组织中丙二醛的生成和保护SOD的活性，但LVT对HTL所致血管内皮细胞（vascular endothelial cells，VEC）损伤的保护作用及机制目前尚不清楚。本研究将在前期工作的基础上进一步探讨LVT对HTL所致血管内皮细胞损伤的保护作用，也为他汀类药物抗AS作用提供新的依据。

1.资料与方法

1.1 主要试剂

人脐静脉内皮细胞株（HUVECs）购自中国典型培养物保藏上海中心细胞库；LVT、HTL和DMEM培养基等均购自Sigma公司；胎牛血清购自杭州四季青生物有限公司。荧光定量PCR引物（IL-l序号为Hs00174097，IL-6序号为Hs00l74131，GAPDH序号为4326317E-0503008）均购Applied Biosystems公司。蛋白定量检测（BCA）试剂盒、蛋白裂解液、IL-1和IL-6单克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 实验分组与细胞培养

HUVECs用含10%胎牛血清的F12K培养基在37℃条件下用含5%CO2的孵箱培养。当HUVECs长到对数期时换成含0.5%FBS的F12K培养基预处理24h使HUVECs出现同步化，然后用于下一步的实验研究。本实验共分为对照组、HTL处理组（1mmol/L的HTL处理24h）和低浓度LVT处理组（先用0.025μmol/L的LVT预处理HUVECs4h，然后再用1mmol/L的HTL处理24h）、中浓度LVT处理组（先用0.05μmol/L的LVT预处理HUVECs4h，然后再用1mmol/L的HTL处理24h）和高浓度LVT处理组（先用0.1μmol/L的LVT预处理HUVECs4h，然后再用1mmol/L的HTL处理24h）。

1.3 细胞内活性氧（ROS）含量测定

各组处理后的HUVECs细胞用胰酶进行消化（0.125%的胰酶与0.02%的EDTA比例为1∶1），然后用无血清的F12K培养基洗3次，并用PBS重悬细胞（4×108/L）。加入用1μL无水乙醇配置的DCFH-DA，于37℃避光水浴30分钟。采用仪器检测各组HUVECs细胞的活性氧含量。

1.4 Western Blotting分析IL-1和IL-6蛋白表达水平

收集各组HUVECs后加入4℃预冷的细胞裂解液裂解细胞收取总蛋白，各组的蛋白浓度采用BCA法进行测定。每孔上样蛋白量为30μg，用SDS-PAGE胶进行电泳，转膜后用无脂奶粉（5%）于常温下封闭1h。加入不同浓度稀释的抗IL-1、IL-6和GAPDH等一抗，在4度下摇床过夜。用1∶5000稀释的HRP标记的二抗于室温下孵育1h，应用化学发光试剂显色，对胶片进行定影和显影，最后对胶片扫描并进行灰度分析。

1.5 统计学分析

采用SPSS15.0统计软件对数据进行分析，以均数±标准差（±s）表示，组间的统计比较应用t检验，采用单因素方差分析（One-WayANOVA）对多组间数据进行比较分析，P＜0.05被认为具有统计学意义。

2.结果

2.1 LVT抑制HUVECs中HTL诱导的ROS的生成

与对照组相比，HTL能明显诱导HUVECs细胞内ROS生成（P＜0.05）；与HTL组相比，LVT可呈浓度依赖性抑制HTL所致的效应（P＜0.05），见图1。

图1 洛伐他汀抑制HUVECs中HTL诱导的ROS

2.2 LVT抑制HUVECs中HTL诱导的IL-1的表达

与对照组相比，HTL能明显诱导HUVECs细胞中IL-1表达；与HTL组相比，LVT可呈浓度依赖性抑制HTL所致的效应（P＜0.05），见图2。

图2 洛伐他汀抑制HUVECs中HTL诱导的IL-1

2.3 LVT抑制HUVECs中HTL诱导的IL-6的表达

与对照组相比，HTL能明显诱导HUVECs细胞中IL-6表达与HTL组相比，LVT可呈浓度依赖性抑制HTL所致的效应（P＜0.05）见图3。

图3 洛伐他汀抑制HUVECs中HTL诱导的IL-6

3.讨论

文献报道，HTL可通过直接以及间接这两种途径影响血管内皮功能。HTL的酐键可与血浆蛋白的赖氨酸ε-氨基起作用，从而改变蛋白的结构以及理化性质。间接途径与HTL影响细胞内信号通路激活有关，可能与HTL促进脂质过氧化物和细胞内ROS生成有关，但具体的分子机制目前尚未清楚。在本研究中，我们取HTL处理的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）复制内皮细胞损伤模型，将HUVECs分为对照组、HTL处理组、低浓度LVT处理组、中浓度LVT处理组和高浓度LVT处理组，用Westernblot检测HTL及LVT对HUVECs中IL-1和IL-6表达的影响。结果发现，HTL可明显增加HUVECs内ROS生成，同时可使IL-1和IL-6的蛋白表达水平均明显增高，而LVT可呈浓度依赖性抑制HTL诱导的HUVECs中IL-1、IL-6的表达。

动脉粥样硬化是一种脂质代谢失调以及炎症性血管病变，AS的发生进展过程中均伴有炎症反应，大量研究表明有许多炎症因子以及炎症细胞参与了AS的形成，如高水平的急性反应蛋白和IL-6可促使AS斑块的形成。研究中，我们发现LVT可通过下调HTL诱导的HUVECs中IL-1和IL-6的表达，参与细胞炎症反应的调节，从而推测他汀类药物可能通过减轻炎症反应，保护血管内皮细胞抑制AS的形成和发展，其精确的机制尚有待进一步的研究。该研究手段为研究HHcy致病机制提供了新的方法，其结果也为他汀类药物的抗AS作用提供新的依据。