不同程度脏腑虚损哮喘患者血浆左旋精氨酸和不对称二甲基精氨酸水平以及肺功能的研究▲

刘慧芳 李风森 姜 敏

(新疆医科大学附属中医医院呼吸科，乌鲁木齐市 830000，电子邮箱：huihui19830303@163.com)

支气管哮喘(哮喘)是一种由多种细胞和细胞组分参与、以气道慢性炎症为特征的异质性疾病。流行病学研究表明，在许多国家和地区哮喘的患病率呈上升趋势，特别是近二十年来其患病率和病死率均呈增加趋势[1]。

细胞分子和动物模型研究结果均显示，线粒体功能障碍可导致氧化磷酸化异常，从而增加细胞活性氧含量从而导致内皮细胞如血管内皮细胞受损[2]。动物实验表明哮喘模型动物的气道中也存在功能改变的线粒体，提示线粒体参与了气道上皮损伤与哮喘的发病机制，即活性氧过多导致氧化/抗氧化失衡，从而引起气道上皮细胞的氧化应激[3-5]。此外，过多的过氧亚硝酸阴离子可以通过降解细胞色素C的血红素基团从而引起细胞损伤和线粒体功能障碍[6]。不对称二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)是左旋精氨酸(L-arginin，L-Arg)甲基化后的产物，其作为内源性一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的抑制剂，能与L-Arg竞争性结合NOS，使NOS解偶联从而生成过氧亚硝酸阴离子[7-8]。而L-Arg与NOS结合是降低ADMA-NOS解偶联的有效途径。此外，已有研究者提出血浆中L-Arg与ADMA的比值可以作为NOS功能受损的指标之一[7，8-10]。基于二者之间的关系，我们认为采用L-Arg/ADMA比值的变化来评估ADMA或L-Arg在体内的变化趋势更有意义。

中医认为，哮病的发生为宿痰内伏于肺，附加外感、饮食、情志、劳倦等因素，以致痰阻气道、肺气上逆所致。哮病的病理因素以痰为主，痰的产生责之于肺不能布散津液、脾虚不能运输精微，肾虚不能蒸化水液，以致津液凝聚化饮成痰，内伏于肺，成为发病的“宿根”，根本因素在于肺脾肾三脏虚损。发病之初以肺虚为主，病情尚轻，以肺系功能异常为主要表现；迁延日久则可因耗伤肺气、肺阴而累及脾脏，发展为肺脾两虚，病情加重；随着病情发展，最终导致肺、脾、肾三脏皆虚，以致水液代谢失常情况愈发严重，宿痰内伏，加之肺虚卫外不固，外邪易侵发病。病位虽在肺，但直关脾肾，且随着脏腑虚损情况的加重，病情也随之加重，存在着肺气虚、肺脾气虚、肺脾肾俱虚的证候演变,脏腑虚损状况反映着病情严重程度。本研究旨在探讨不同程度脏腑虚损哮喘患者L-Arg/ADMA比值和肺功能的变化情况及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016年11月至2017年5月在我院门诊及住院部确诊为哮喘急性发作期的122例患者作为哮喘组,其中男41例，女81例；年龄17～65(48.34±10.49)岁；肺气虚者47例，肺脾气虚者39例，肺脾肾虚者36例。纳入标准：(1)符合哮喘急性发作期的诊断标准，并能接受病情观察和各项检查；(2)年龄16～65岁；(3)能够理解研究目的，并签署知情同意书，自愿参加研究的患者。排除标准：(1)妊娠或哺乳期妇女；(2)合并肺源性心脏病、肺癌、结核、肺纤维化等其他呼吸系统疾病及呼吸衰竭接受或未接受机械通气者；(3)任何部位恶性肿瘤、免疫性疾病、血液病、内分泌系统疾病者；(4)精神病患者或精神异常患者。选择同期在我院进行体检的44例健康正常人作为正常对照组。其中男15例，女29例；年龄24～64(47.66±10.89)岁，4组研究对象一般资料差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

表1 4组研究对象一般资料的比较

1.2 诊断标准

1.2.1 支气管哮喘诊断标准：支气管哮喘根据中华医学会呼吸病学分会哮喘学组制定的《支气管哮喘防治指南(2016年版)》中的诊断标准[11]进行诊断。

1.2.2 中医诊断标准及中医脏腑虚损评定标准：参照《临床中医内科学》[12]中“哮病”和《中医诊断学》[13]中“脏腑辨证”的诊断标准，并参照支气管症候诊断的相关文献[14]制定。(1)肺气虚：气短、喘息、咳嗽，动则加重；神疲、乏力或自汗；恶风；舌质淡、苔白，脉沉细或细弱或濡缓无力。(2)肺脾气虚：咳嗽、气短、喘息，活动后加重，痰清稀；纳呆或食少；胃脘胀满或食后胀甚或便溏；神疲乏力，少气懒言，面白恶风，自汗易感；舌体胖大或有齿痕，舌苔薄白或腻，脉沉细或沉缓或细弱。(3)肺脾肾虚：咳嗽、气短、喘息，不动时即感喘，呼多吸少；腰膝酸软，小便频数清长，夜尿或遗尿；纳呆或食少；胃脘胀满或食后胀甚或便溏；恶风自汗，畏寒肢冷；舌质淡，舌苔白，脉沉细无力。

1.3 血浆L-Arg及ADMA的检测

1.3.1 标本采集及处理：采集研究对象静脉血5 ml置入乙二胺四乙酸抗凝管，哮喘患者为停用吸入性糖皮质激素7～14 d后留取标本。将标本3 500 r/min离心15 min后取上清液，分装于EP管中，-80℃保存。

1.3.2 主要试剂和仪器：(1)L-Arg及ADMA标准品购自Sigma公司(批号：140321、140524)，13C6-L-Arg购自剑桥同位素实验室有限公司(批号：MA01810)；甲酸、乙腈、甲醇：均为色谱纯，购自Sigma公司。(2)K3型酶标仪、NanoDrop 8000型分光光度仪、Thermo Sorvall ST16型常温离心机、Thermo Legend Micro型低温离心机均购自Thermo Fisher Scientific公司，KD-8D型电热恒温培养箱购自上海精宏公司，ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪-TQ-D三重四级杆质谱系统及Waters ACQUITY UPLC®BEH C18色谱柱(2.1×100 mm，1.7 μm)、ACQUITY UPLC®BEH C18保护柱(1.7 μm)均购自Waters公司，超滤离心管(10 000 Da)购自Millipore公司。

1.3.3 检测方法：(1)样品的前处理：取血浆500 μl，加入蛋白沉淀剂甲醇-乙腈(1 ∶3)溶液1 ml，涡旋2 min；常温下1 000 r/min离心5 min，取上清约700 μl加入超滤管；常温下10 000 r/min离心5 min；将样品吸取至样品瓶，待测。(2)采用高效液相联合质谱法检测L-Arg及ADMA水平。液相色谱条件：采用ACQUITY UPLC®BEH C18(2.1×100 mm，1.7 μm)色谱柱，以0.1%甲酸水溶液为流动相A，以0.1%甲酸甲醇溶液为流动相B，按表2的条件进行梯度洗脱，流速为0.2 ml/min，柱温为35℃，进样量为5 μl。质谱条件：采用ESI+正离子离子化模式,进行多反应监测，毛细管电压2.60 kV，离子源温度为120℃，锥孔气流量为150 L/h，脱溶剂气温度为450℃，脱溶剂气流速为500 L/h，具体参数见表3。

表2 液相梯度洗脱条件

表3 化合物测定质谱具体参数

1.4 肺功能测定 用药前采用日本Chest公司Hi 198型肺功能测定仪对哮喘患者进行肺功能检测，观察指标包含1 s用力呼气容积(forced expiratory volume in one second,FEV1)、FEV1/用力肺活量的比值(FEV1/forced vital capacity ratio,FEV1/FVC)、呼气流量峰值(peak expiratory flow,PEF)。检查的注意事项：检查时不用鼻呼气，需用嘴呼吸，保证检查过程中不漏气。

1.5 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；计数资料以例数(百分比)表示，比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 哮喘组与正常对照组血浆ADMA、L-Arg水平及L-Arg/ADMA比值比较 两组的血浆ADMA水平差异无统计学意义(P>0.05)，哮喘组的L-Arg水平及L-Arg/ADMA比值均低于正常对照组(均P<0.05)，见表4。

表4 哮喘组与正常对照组血浆ADMA、L-Arg水平及L-Arg/ADMA比值比较(x±s)

2.2 不同程度脏腑虚损哮喘患者肺功能比较 肺气虚组、肺脾气虚组、肺脾肾虚组患者FEV1、FEV1/FVC、PEF均依次降低(均P<0.05)，见表5。

表5 不同程度脏腑虚损哮喘患者肺功能比较(x±s)

注：两两比较，均P<0.05。

2.3 不同程度脏腑虚损哮喘组与正常对照组血浆L-Arg、ADMA水平、L-Arg/ADMA比值比较 各脏腑虚损组的L-Arg水平、L-Arg/ADMA比值均低于正常对照组(均P<0.05)，但不同脏腑虚损哮喘组间比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。4组的ADMA水平差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表6。

表6 不同程度脏腑虚损哮喘患者与正常对照组血浆L-Arg、ADMA水平及L-Arg/ADMA比值比较(x±s)

注：与正常对照组比较，*P<0.05。

3 讨 论

目前，有研究表明在心血管疾病等多种其他疾病中ADMA水平的升高可导致细胞线粒体功能受损[15-18]。1型和2型糖尿病大鼠的血浆ADMA含量明显升高，而反映心肌线粒体细胞色素C氧化酶与线粒体合成的关键调节因子——过氧化物酶体增殖物活化受体γ共激活因子-1α转录明显减少；老年大鼠血浆内源性ADMA水平升高，伴心肌线粒体生物合成减少，且两者呈负相关，而外源性ADMA可直接抑制心肌细胞线粒体生物合成与三磷酸腺苷生成[19-20]，提示ADMA能导致心肌组织线粒体生物合成障碍，这与ADMA水平的升高而引起L-Arg/ADMA比例下降有关。

本研究结果显示，哮喘组血浆L-Arg水平及L-Arg/ADMA比例低于正常对照组(均P<0.05)，且各脏腑虚损组的L-Arg水平、L-Arg/ADMA比值亦均低于正常对照组(均P<0.05)。提示不同脏腑虚损的哮喘患者机体均存在精氨酸代谢紊乱、L-Arg/ADMA比例的失衡和NOS功能的受损，而这可能会影响线粒体功能。当L-Arg水平下降时，L-Arg/NOS/NO通路(即NO的生成过程)的底物缺乏或不足，而由于L-Arg和ADMA存在相互竞争结合NOS的关系，此时ADMA处于相对剩余状态，那么作为限速酶的NOS不能够充分与L-Arg结合发挥其功能生成NO，就会被ADMA解耦联产生大量的过氧亚硝酸阴离子而损伤线粒体呼吸链。并且目前相关研究已表明哮喘患者血浆NOS水平升高[21]，但正是由于L-Arg的不足而被大量解耦联，L-Arg/ADMA比例的失衡正是反映了NOS的功能受损。因此，我们认为L-Arg/ADMA比例下降是引起哮喘患者线粒体呼吸链损伤、大量活性氧蓄积的重要原因；而造成哮喘患者机体内L-Arg/ADMA比例失衡的根本原因可能是L-Arg的不足。但在本研究中，不同程度脏腑虚损哮喘患者精氨酸的代谢水平差异无统计意义。

中医脏腑虚损理论认为肺脾肾三脏虚损与哮喘发病的轻重程度密切相关，脏腑虚损状况反映着病情严重程度，从发病之初的咳喘到呼吸衰竭的病情进展过程中，存在着肺气虚、肺脾气虚、肺脾肾俱虚的证候演变和脏腑传变规律，脏腑虚损状况和传变规律在某种程度上反映了病情的进展趋势[22-24]。本研究中，肺气虚组、肺脾气虚组、肺脾肾虚组患者FEV1、FEV1/FVC、PEF均依次降低(均P<0.05)，即随脏腑虚损情况的加重，哮喘患者的肺功能下降。这提示肺脾肾三脏虚损状况反映着病情的进展趋势，用脏腑虚损理论对临床症状等外在表象的判断进行辨证分型对哮喘患者临床病情进展的估测有一定的可行性。

总之，不同程度脏腑虚损哮喘患者机体均存在精氨酸代谢紊乱、L-Arg/ADMA比例的失衡，这可能是引起哮喘患者线粒体呼吸链损伤、大量活性氧蓄积的重要原因；但不同程度脏腑虚损哮喘患者精氨酸的代谢水平并无差异。哮喘患者肺功能变化与脏腑虚损发展趋势具有一致性。