破骨细胞分化因子及基质金属蛋白酶-2在外耳道胆脂瘤中的表达及意义

赵昱 彭军 刘汝利

(1.华北理工大学附属医院耳鼻咽喉头颈外科 唐山 063000；2.河北省唐山市人民医院耳鼻咽喉头颈外科 唐山 063000)

外耳道胆脂瘤(external auditory canal cholesteatoma, EACC)是由各种原因引起的外耳道鳞状上皮增生形成的胶质碎片聚集，内含胆固醇结晶[1]。该病是一种边界清楚的良性囊性病变，因具有类似于恶性肿瘤的侵袭特性，常导致周围骨质结构不同程度的吸收、破坏。EACC早期病变局限在外耳道，随着病情发展可侵及鼓膜，晚期可突破鼓膜侵及鼓室或乳突[2]。该病破坏力强，如不及时清除病变组织，可广泛破坏骨质，严重者可引起颅内、外并发症。对周围骨质的进行性溶骨性破坏是EACC最重要的病理生理学特征，其发生机制也一直受到众多耳鼻喉科学者的重视。既往研究发现，细胞因子参与的骨质破坏以及酶类介导的骨质吸收在EACC的发生、发展中起到了重要作用，其中破骨细胞分化因子(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)与基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)的表达越来越受到关注。本研究采用免疫组化方法检测RANKL与MMP-2在EACC中的表达情况，观察两者表达水平与患者骨质破坏程度的相互关系以及两者之间的相关性，从而进一步探讨EACC骨质破坏的可能发生机制。

1 材料与方法

1.1 标本来源 选取2015年6月～2018年5月华北理工大学附属医院和唐山人民医院耳鼻咽喉科EACC患者手术标本共47例为观察组，男性29例、女性18例；年龄14～62岁,平均36.5岁；均为单侧耳发病；病程3个月～16年。经临床及病理检查证实为EACC。选取同期18例外耳道外伤(或者乳突根治术+外耳道成形术)患者外耳道骨段正常皮肤为对照组。观察组纳入标准:①术前均行耳部专科检查、颞骨高分辨率CT检查，所有标本术后均经病理学确诊为EACC；②均为第1次接受治疗。排除标准:①伴有耳道其他病变，伴有其他慢性炎症性疾病，或既往有耳部手术史的患者；②手术前接受过相关药物治疗的患者。根据临床特点及颞骨高分辨CT检查，Shin等[3]将EACC分为以下4型，以此来划分骨质破坏程度。Ⅰ型：胆脂瘤致外耳道局限性扩展，骨壁破坏，但病变仅局限在外耳道；Ⅱ型：胆脂瘤破坏范围超出外耳道，侵犯至鼓膜以及中耳范围；Ⅲ型：胆脂瘤不仅造成外耳道骨壁的缺损，而且累及乳突气房；Ⅳ型：胆脂瘤病变超出颞骨范围。本组病例中，Ⅰ型7例，外耳道骨壁局限性扩展，骨壁被破坏；Ⅱ型20例，4例单纯侵及鼓膜，但鼓室内未见骨质破坏，16例同时侵及鼓膜及鼓室，未侵及鼓窦、乳突；Ⅲ型18例，单纯经外耳道后壁侵及乳突11例，同时侵及鼓室及乳突7例；Ⅳ型2例，分别侵及硬脑膜与颞颌关节。

1.2 方法 所有标本于术中取出后立即浸泡于10%甲醛中，常规脱水，石蜡包埋，作3～4 μm厚的连续切片。兔抗人RANKL 、MMP-2多克隆IgG抗体均购自北京博奥森生物有限公司，免疫组化试剂盒和二氨基联苯胺显色盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。所有抗体均为浓缩液，预先稀释成不同浓度的工作液进行预实验，以最理想的染色浓度(1∶400)用于正式实验。所有切片均经多聚赖氨酸及高温、高压预处理，按照免疫组化EnVision法常规程序进行染色。用已知阳性片做阳性对照，磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗做阴性对照。

1.3 判定标准 根据显色范围和强度2个方面进行判断，RANKL与MMP-2阳性信号均为细胞质出现棕黄色或棕褐色颗粒。结果由2位病理科医师进行双盲法阅片综合评出。MMP-2以每个视野下黄色及棕黄色颗粒细胞数占视野中所有细胞数的百分比作为阳性细胞率，每张切片随机取5个400倍视野，观察计数后取平均值，以阳性细胞率≤10%为阴性、>10%～25%为弱阳性、>25%～50%为阳性、>50%为强阳性[4]。RANKL以相同方法进行判读。

1.4 统计学处理 利用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行χ2检验、确切概率法检验和相关性分析，检验水准α=0.05,均以P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组RANKL与MMP-2的表达与比较 免疫组化结果显示，RANKL和MMP-2 主要表达于细胞质。47例EACC标本中，RANKL与MMP-2表达阳性率分别为 76.60%(36/47)和78.72%(37/47，图1)；18例对照组标本中，RANKL与MMP-2表达阳性率分别为11.11%(2/18)和16.67%(3/18，图2)。两者比较，差异均有统计学意义(χ2=22.983、21.177，P值均<0.05)。

图1. MMP-2(A)、RANKL(B)分别在EACC中的阳性表达，细胞质内可见大量棕黄色或棕褐色颗粒分布(EnVision法×200)

图2. MMP-2(A)、RANKL(B)分别在外耳道正常皮肤中的阳性表达，细胞质内无明显或可见极个别的棕黄色颗粒，数量少，分布稀疏(EnVision法×400)

2.2 EACC中RANKL、MMP-2的表达与临床病理特征以及骨质破坏程度与病程的关系 观察组中RANKL、MMP-2的阳性表达与EACC患者的性别、年龄、发病部位均无明显相关性(P>0.05)，与骨质破坏程度有明显相关性(P<0.05，表1)。骨质破坏程度与病程有明显相关性(P<0.05，表2)。

表1 EACC组中RANKL和MMP-2的表达与临床病理特征的关系[n(%)]

表2 骨质破坏程度与病程之间的关系[n(%)]

2.3 EACC组织中RANKL和MMP-2表达之间的关系 观察组中，RANKL和MMP-2 同为阳性者33例，同为阴性者7例，两者之间呈显著相关性(γ=0.572，P=0.000；表3)。

表3 RANKL 、MMP-2在EACC组织中表达的相关性分析(n)

2.4 RANKL和MMP-2的表达对EACC的诊断价值 由表4可以看出，RANKL、MMP-2诊断EACC的ROC下面积分别为0.827、0.810，说明RANKL和MMP-2对EACC的诊断价值均较好。对应的灵敏度和特异度分别为76.6%、88.9%和78.7%、83.3%。结果见表4和图3。

表4 RANKL、MMP-2诊断EACC的价值分析

图3. RANKL 、MMP-2诊断EACC的ROC

3 讨论

EACC是一种外耳道的慢性炎症，其临床特点为外耳道鳞状上皮增生形成的胶质碎片堆积，并对周围组织产生破坏[5]。该病的发生机制是多因素相互作用的复杂过程,具有明显的侵袭特性。对邻近骨质的侵袭及破坏是该病最重要的临床特征，并且随着病情的发展，胆脂瘤体积的增大，周围骨壁结构会被破坏得越加严重，其危害及预后主要取决于胆脂瘤对周围骨质结构的吸收、破坏程度。近些年有不少学者发现在较小体积的EACC中同样观察到骨质破坏，说明其骨质破坏机制并非只是膨胀性的压迫[2，6]。Jung等[7]研究发现，胆脂瘤的骨质破坏发生机制与破骨细胞的活化水平有密切关系，破骨细胞可能是胆脂瘤骨质破坏机制中起最终作用的关键细胞。破骨细胞在体内是一个具有高度专业化的骨吸收细胞，来源于造血干细胞的单核-巨噬细胞前体分支，可直接参与骨质的降解，是生理状态下骨组织吸收的主要功能细胞。目前更多学者认为，骨质的吸收、破坏是由于在局部炎性环境刺激下产生的各种蛋白分解酶[8]及多种细胞因子，通过不同途径调节破骨细胞的活性最终引发骨膜炎或骨质溶解吸收。RANKL、MMP-2对破骨细胞有重要的调节功能，均可激活其活性，使之发挥降解骨质的功能。

RANKL是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族的成员，是诱导破骨细胞活化的关键细胞因子。RANKL与其配体核因子-κB受体活化因子(RANK)在巨噬细胞集落刺激因子存在的情况下结合，通过 RANKL-RANK-骨蛋白酶(osteoprotegerin, OPG )通路对破骨细胞的活化进行复杂的反馈调控，从而引发骨的降解、退化。而上述机制可被OPG抑制。OPG归属于TNF家族，是一种生长因子受体。OPG可直接与RANKL结合，阻断RANKL/RANK之间的相互作用，抑制破骨细胞活化、成熟，从而减少骨质吸收。OPG与RANKL在体内骨组织中的相对表达水平对破骨细胞的活化或抑制具有决定性的作用。可见，RANKL/OPG比值好比一个杠杆，在体内骨降解和骨形成的平衡关系中发挥着无可替代的作用。RANKL-RANK-OPG是人体内骨质吸收的共同通路，而RANKL作为破骨细胞分化和调节骨吸收的关键因子，可直接影响破骨细胞的功能，是促进骨质吸收的关键因素。本研究结果显示，RANKL在EACC组织中的阳性表达率明显高于对照组，并且RANKL的阳性表达随着骨质破坏程度的加重而增强，破骨细胞数量也明显增多，因而推测RANKL参与了EACC的骨质破坏过程，且其表达和分布与破骨细胞的形成密切相关。这与Hamzei等[9]的实验结果相符。在胆脂瘤上皮层和上皮下组织中观察到大量炎性细胞，如T淋巴细胞、树突状细胞、中性粒细胞等，并且高表达RANKL,而在对照组中并没有发现这一现象，提示炎症反应与细胞因子间的相互调控在胆脂瘤的发生、发展中发挥着非常重要的作用。这些炎性细胞通过高表达RANKL，从而激活破骨细胞，引发骨质溶解吸收[10-11]。由本实验可以认为，RANKL在EACC骨质破坏机制中具有重要的生物学功能，进一步提示破骨细胞的分化、活化可能在EACC骨质破坏机制中起重要作用。

MMPs是在结构上具有很多共同生化性质可降解细胞外基质的一组内肽酶的总称，因含Zn2+和Ca2+而得名,在体内由多种基质细胞和炎症细胞分泌,并且在组织重建与修复、炎症反应、肿瘤血管生成及侵袭转移中发挥重要作用[12]。MMP-2是MMPs在体内分布最广的家族成员之一，属于蛋白水解酶，在降解基底膜及细胞外基质方面具有重要作用 ,是降解Ⅳ型胶原最主要的酶，主要由成纤维细胞产生，分布在胆脂瘤上皮下结缔组织中，是骨有机基质降解的主要因素，可直接参与生理性和病理性溶骨机制。Chole[13]认为,胆脂瘤骨质破坏的发生主要是由于破骨细胞的作用，MMPs在胆脂瘤中高表达，可以通过清除骨组织的骨样表面，促进破骨细胞的活性，从而发生骨质吸收、破坏。破骨细胞与成骨细胞在骨质破坏过程中活性增强，分泌MMPs，并相互激活，降解骨基质，从而成为胆脂瘤的侵袭力和破坏力[14]。可见，MMPs在EACC的骨质破坏中发挥了重要作用。本研究结果显示，MMP-2在EACC中的阳性表达显著高于对照组，并且骨质破坏程度越高MMP-2的阳性表达率越高，该实验结果与周旭峰等[15]的结果相符。同时在胆脂瘤上皮及基质周围发现炎性细胞与MMP-2共同表达，且在骨质破坏严重的标本中两者表达明显增强，破骨细胞的数量也相应增多。基于以上发现推测，EACC骨质吸收可由炎症细胞分泌MMP-2引起破骨细胞活化而引发。

本实验结果显示，EACC组织中RANKL与MMP-2表达明显高于对照组，两者表达水平呈正相关，且随着两者表达水平的提高，骨质破坏程度也加重，从而分析两者的表达水平与骨质破坏程度具有相关性，推测两者共同参与了EACC的骨质破坏过程，并且在骨吸收方面可能具有协同作用。本实验未观察到两者的表达与患者性别、年龄、发病部位等因素的相关性。本研究结果还发现，患者的病程越长，骨质破坏程度越严重；骨质破坏程度与病程具有很大的相关性，说明病程在EACC骨质破坏的发生、发展中是一个不可忽视的重要因素。根据ROC图分析显示，RANKL、MMP-2在EACC中的高表达对于诊断该病有着较高的灵敏度与特异度。

EACC和中耳胆脂瘤虽然在发病部位与侵袭方向以及发病机制方面不同，但在病理组织学上的表达无明显差异。根据许多学者的研究结果[15-19]以及本实验结果进行联合分析，RANKL、MMP-2在EACC与中耳胆脂瘤中阳性率的表达无明显差异，均为高表达，并与骨质破坏密切相关。因而，该实验结果对于临床诊疗胆脂瘤也许可以提供一个新的理论依据，并可能为有效治疗胆脂瘤提供有效线索。

综上所述，EACC组织中RANKL、MMP-2表达上调，可能在EACC骨质破坏过程中发挥了重要的生物学功能，是该病病情进展的一个潜在危险因素。两者以直接或间接的方式激活破骨细胞并上调其活性，从而加速骨细胞凋亡和骨基质降解，促进骨吸收，导致骨质破坏。将两者作为生物学标志物进行联合检测，不仅有利于对EACC患者病变程度及预后进行评估，还对该病有着较高的诊断价值。