MEK抑制剂PD0325901显著提高猪胎儿成纤维细胞ssODN介导的HDR效率

欧浩，李国玲，王豪强，黄广燕，蔡更元,2，李紫聪，吴珍芳,2，张献伟,2



MEK抑制剂PD0325901显著提高猪胎儿成纤维细胞ssODN介导的HDR效率

欧浩1，李国玲1，王豪强1，黄广燕1，蔡更元1,2，李紫聪1，吴珍芳1,2，张献伟1,2

1. 华南农业大学动物科学学院，国家生猪种业工程技术研究中心，广州 510642 2. 温氏食品集团股份有限公司，新兴 527400

基因组DNA发生双链断裂(double strand break, DSB)后主要通过同源定向修复(homologous-directed repair, HDR)和非同源末端连接(nonhomologous end joining, NHEJ)两种途径进行修复，其中单链寡聚核苷酸(single-stranded oligodeoxyribonucleotide, ssODN)介导的同源定向修复是动物基因组常用的基因组定点修饰技术，具有较大的科研和应用价值。为提高猪基因组ssODN介导HDR效率，本研究以猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts, PFFs)为研究对象，利用丝裂原活化的细胞外信号调节激酶(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase, MEK)抑制剂PD0325901培养细胞，研究其对HDR效率的影响及作用分子机理。结果显示，PD0325901能显著提高PFFs的G2期和S期细胞群百分比，减少G1期细胞群比率，促进HDR修复因子的表达。在最适浓度250 nmol/L时，PD0325901使ssODN介导的GFP报告载体的修复效率提高了58.8%；同时使PFFs基因组位点和定点修饰效率分别提高了48.16%和17.64%。本研究表明，MEK抑制剂PD0325901能显著提高猪基因组ssODN介导的同源定向修复效率，为高效制备定点基因修饰动物模型提供了新思路。

MEK抑制剂；同源定向修复(HDR)；PD0325901；基因编辑

传统转基因技术是将目的基因随机整合到基因组中并使之表达，无法控制转基因的整合位点，且伴随着效率低、表达稳定性差等问题，为转基因动物品系和育种品系的建立带来诸多不便。随着锌指核酸内切酶(zinc-finger endonuclease, ZFN)[1]、类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)[2]、规律成簇的间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)[3]，以及结构引导的核酸酶(structure- guided nuclease, SGN)[4]等新型基因编辑技术的出现，使动物基因组DNA突变的效率和准确性大大提高，推动了基因定向修饰动物的研究[5]。新型基因编辑技术可在基因组内高效产生双链断裂(double strand break, DSB)，激活细胞中两种DNA修复路径——同源重组定向修复(homologous-directed repair, HDR)和非同源末端连接(nonhomologous end joining, NHEJ)。NHEJ无需同源修复模板，由NHEJ修复因子将DNA双链断裂的两端强行拼接起来，容易造成基因片段的缺失、突变或外源基因的插入等，是基因敲除的有效途径；HDR路径需要同源DNA模板，修复过程产生错误的概率较低，是定向突变和定点敲入(knock-in, KI)最为依赖的修复路径[6]。尽管运用新型基因编辑工具能够使细胞DNA发生DSB的效率和准确性极大的提高，但双链DNA模板修复效率相对较低，只有0.5%~20%左右，利用HDR进行高效的定点敲入具有较大的难度[3,7]。相比双链DNA模板，单链寡聚核苷酸(single-stranded oligodeoxyribonucleotide, ssODN)作为同源修复模板具有更高的定向修复效率[8~10]。目前，ssODN介导的DNA修复的具体通路仍然不是很清楚，但该途径也需要在DSB的断裂末端进行DNA末端剪切(DNA resection)，因此与其他HDR通路具有相同的起始途径[11]。一般认为ssODN介导的同源定向修复途径也属于HDR的一种，有研究表明通过小分子化合物调控HDR通路，可以促进ssODN介导的定向修复效率。Maruyama等[12]使用小分子化合物Scr7(DNA连接酶Ⅳ抑制剂)将ssODN介导的定点整合效率提高了19倍；将Scr7直接注射至小鼠受精卵，使定点整合效率提高2倍。Ma等[13]使用VE-822 (Rad3相关激酶抑制剂)和AZD-7762 (检查点激酶CHEK1的特异性抑制剂)将ssODN介导的定点整合效率提高3倍。虽然这些小分子化合物可显著提高HDR效率[14]，但都主要集中在对人和小鼠的研究，对猪的研究鲜有报道[15,16]。由于大部分小分子化合物对细胞和胚胎存在一定的毒害作用，剂量过大会损伤细胞或基因编辑胚[17]，因此小分子化合物的使用剂量和新化合物的开发还需要继续优化。

RAS-RAF-MEK-ERK信号通路是调节细胞增殖、分化、代谢、凋亡和细胞周期等众多细胞生理过程的主干信号通路，丝裂原活化的细胞外信号调节激酶(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase, MEK)是该信号通路的重要组成部分[18]。PD0325901是一种选择性的非ATP竞争性MEK抑制剂，其与MEK结合会使MEK与ATP结合位点的构象发生变化，从而抑制MEK的激活[19,20]。Lin等[21]研究显示，使用PD0325901和CHIR99021 (GSK3β抑制剂)能消除ESC (embryonic stem cell)细胞系之间同源重组效率的差异，表明MEK信号通路可能参与细胞DNA的同源重组修复，但该信号通路是否参与体细胞同源重组目前还没有研究报道。

猪的生理学、解剖学和遗传学特征与人类非常相似，是研究人类疾病的重要动物模型。杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy, DMD)是一种X连锁隐性遗传病，由基因突变导致的人类肌肉萎缩无力，丧失独立行走能力为特点的疾病，提高猪该位点的定点编辑效率对制备人类DMD疾病猪模型具有重要意义[22]。此外，基因位点是猪基因组上最常用的安全港位点，外源性的基因定点插入该位点能高效稳定表达，同时不会影响其他内源基因的表达，因此常用该位点来构建基因编辑猪模型[23]。本研究以猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts, PFFs)为研究对象，以和位点为靶点，利用MEK抑制剂PD0325901提高PFFs细胞中ssODN介导定向修复效率，为高效制备基因定向编辑猪模型提供重要参考信息。

1 材料与方法

1.1 材料

报告载体ssODN-mediated HDR reporter由本实验室前期构建[24]。该报告载体中(enhanced green fluorescent protein)序列中间插入一个终止密码子和一个HⅠ限制性内切酶位点，HⅠ用于线性化报告载体；该报告载体能与基因相应的同源模板重组，使表达绿色荧光信号，而没有发生同源定向修复的则被提前终止翻译。Cas9/sgRNA共表达质粒pX330 (Plasmid #42230)购自美国Addgene公司；PFFs细胞由温氏食品集团股份有限公司提供；MEK抑制剂PD0325901购自美国Selleck公司；引物和ssODN由深圳华大基因科技有限公司合成。

1.2 Cas9/sgRNA共表达质粒的构建

在CCtop CRISPR/Cas9网站(https://crispr.cos. uni-heidelberg.de/index.html)设计和基因的sgRNA[25,26]，序列见表1。sgRNA引物混匀后置于95℃水中自然冷却至室温，使其形成双链DNA，克隆到pX330-U6-hSpCas9质粒的Ⅰ位点上。

1.3 PD0325901配制及细胞培养

取适量PD0325901溶解于DMSO溶剂，添加至完全培养基(DMEM细胞培养基+10%胎牛血清)分别配置成25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L和250 nmol/L的溶液备用，复苏后的PFF细胞培养至汇合度90% (10 cm板)，进行后续实验。

表1 sgRNA序列信息

1.4 MTT法检测细胞活性

复苏后的PFF细胞培养至汇合度90% (10 cm板)，用0.25%胰酶消化，调整细胞密度为103~105个/孔至96孔板，加入100 µL/孔不同浓度梯度的培养基溶液，每个梯度设置8个重复，培养48 h。加20 μL/孔MTT溶液(5 mg/mL，即0.5%MTT)，培养4 h后去掉孔内培养液，加150 μL/孔二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值，对结果进行统计分析。

1.5 流式细胞术检测细胞周期

复苏后的PFF细胞培养至汇合度90% (10 cm板)，用0.25%胰酶消化，铺至6孔板，加入2 mL/孔不同浓度梯度的培养基溶液，每个梯度设置3个重复，继续培养48 h。消化细胞至1.5 mL离心管并去掉培养基，每管加500 μL预冷的70%乙醇(−20℃)，重悬，置于4℃固定过夜。隔天每管加500 μL碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色液，充分振荡，4℃避光孵育30 min，使用流式细胞仪进行检测，利用软件Modifit 5.0进行统计分析。

1.6 HDR和NHEJ相关基因表达水平的检测

复苏后的PFF细胞培养至汇合度90% (10 cm板)，用0.25%胰酶消化，铺至6孔板，加入2 mL/孔不同浓度梯度的培养基溶液，每个梯度设置3个重复，继续培养48 h。使用RNA抽提试剂盒抽提总RNA，反转录后对cDNA进行实时荧光定量PCR检测，分析NHEJ相关基因和HDR相关基因的表达水平。qRT-PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性15 s，60℃复性15 s，72℃延伸15 s，40个循环；溶解曲线95℃ 30 s；60℃ 30 s；95℃ 30 s。qRT-PCR引物见表2。

1.7 ssODN介导的HDR效率检测

复苏后的PFF细胞培养至汇合度90% (10 cm板)，用0.25%胰酶消化。参考美国Thermo fisher公司的Lipofectamine® LTX & Plus Reagent protocol说明书，共转染8 μg/孔线性化的ssODN-mediate HDR reporter (HⅠ酶切)和1 μg/孔ssODN (序列见表3)，每个处理设置3个重复。铺至6孔板培养24 h，加入2 mL/孔不同浓度梯度的培养基溶液，继续培养48 h，使用流式细胞术检测细胞荧光数的百分比。

表2 qRT-PCR引物序列信息

复苏后的PFF细胞培养至汇合度90% (10 cm板)，用0.25%胰酶消化，分别共转染8 μg/孔pX330--Cas9质粒和1 μg/孔ssODN、8 μg/孔pX330--Cas9质粒和1 μg/孔ssODN(序列见表3)，每个处理设置3个重复。铺至6孔板培养24 h，加入2 mL/孔不同浓度梯度的培养基溶液，继续培养48 h。抽提细胞总DNA，PCR扩增目的基因序列(引物序列见表 4)。回收纯化后分别使用T7 EndoⅠ和dⅢ酶切，进行琼脂糖凝胶电泳分离，灰度扫描电泳条带，根据公式：同源定向修复效率=dⅢ条带灰度值/T7 EndoⅠ条带灰度值，计算同源定向修复效率。同时按照中美泰和生物技术有限公司clone smarter TA克隆试剂盒(产品编号C5853)说明书，对纯化的DNA进行TA克隆测序，计算同源定向修复效率。

表3 ssODN序列信息

表4 PCR引物序列

1.8 数据分析

采用 SPSS21 软件进行独立样品-test分析，分析每个处理组与对照组的差异，数据以 Mean ± SEM表示。*<0.05表示差异显著，**<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 PD0325901对PFFs细胞活性和细胞周期分布的影响

PFF细胞经25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L和250 nmol/L浓度的PD0325901处理，使用MTT方法检测细胞增殖活性。结果显示，25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L浓度下细胞活性比对照组分别提高了17.2%、5%、10.12%，经250 nmol/L PD0325901处理后，细胞活性比对照组下降了6.35%。低浓度(25 nmol/L)对细胞活性有促进作用，而高浓度(250 nmol/L)对细胞活性具有一定的抑制作用，但差异不显著(>0.05)，表明这4个浓度梯度的PD0325901对细胞活性没有影响(图1A)。流式细胞术检测细胞结果显示，随着PD0325901浓度增加，处于G2期和S期的PFFs细胞群显著增加(<0.05)，处于G1期细胞群显著减少(<0.05) (图1B)，细胞表现一定程度的同步化。

2.2 PD0325901对DNA修复因子表达水平的影响

PFFs细胞经不同浓度的PD0325901处理后，进行qRT-PCR检测。结果显示，NHEJ相关修复基因(和)和HDR相关修复基因(、、和)表达量随PD0325901添加剂量的升高呈现不规律变化(图2)。在NHEJ通路中，25 nmol/L和250 nmol/L PD0325901对和表达具有上调作用；但对于基因表达，仅250 nmol/L剂量对其具有上调作用。在HDR通路中，不同浓度PD0325901对和表达都有上调作用，在250 nmol/L剂量下，和基因表达量提高近3倍(0.05)，但二者表达量与PD0325901添加量不存在剂量依赖效应；然而对于和基因，100 nmol/L PD0325901对二者的表达呈现下调作用(<0.05)，而经其他剂量处理后，和基因的表达量均表现不同程度的上调作用。

图1 PD0325901对细胞活性和细胞周期的影响

A：不同浓度的PD0325901对细胞活性的影响；B：不同浓度的PD0325901对细胞周期的影响。*<0.05，表示差异显著。

图2 PD0325901对DNA修复因子表达水平的影响

和为NHEJ相关修复基因；和为HDR相关修复基因。

*<0.05，表示差异显著，**<0.01表示差异极显著。

2.3 PD0325901对ssODN介导的HDR效率的影响

ssODN介导的HDR报告载体和相应ssODN共转染至PFF细胞，流式细胞术结果显示，25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L和250 nmol/L浓度PD0325901均能提高HDR效率，提高了32.3%~58.8% (0.05) (图3，A~C)。X330--Cas9质粒和相应的ssODN共转染至PFF细胞后，用dⅢ酶切方法评估基因位点编辑效率。结果显示，25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L和250 nmol/L浓度PD0325901均能提高HDR效率，达2.6%~37.1% (图3，E和F)，并表现明显的剂量依赖效应。共转染pX330--Cas9质粒和相应的ssODN，用dⅢ酶切方法评估基因编辑效率。结果显示，25 nmol/L、50 nmol/L和250 nmol/L PD0325901促进位点HDR效率，分别提高了4.8%、0.8%和9.6% (图3，H和I)，但100 nmol/L剂量时，位点HDR效率略微下降。进一步利用TA克隆和测序验证，结果显示，在250 nmol/L PD0325901剂量下和基因位点的HDR效率分别提高了48.16%和17.64% (表5；图3，J和K)，与dⅢ酶切结果基本一致。

A：ssODN介导的HDR报告载体修复模式图；B：报告载体HDR修复效率的流式细胞术检测结果(用EGFP荧光细胞百分比表示HDR效率)；C：PD032590处理组间ssODN介导报告载体HDR修复的效率比较(=3)。*<0.05，表示差异显著，**<0.01表示差异极显著；D和G：ssODN介导dⅢ识别序列定点整合至猪基因组模式图。D图为基因位点，G图为基因位点；E和H：核酸内切酶酶切法检测位点(图E)和位点(图H)编辑效率电泳结果。T7 EndoⅠ为T7核酸内切酶Ⅰ酶切电泳图，图上的数字表示灰度扫描数值，代表目标位点发生DSB的效率；dⅢ为dⅢ限制性核酸内切酶酶切电泳图，图上数字表示灰度扫描数值，代表目标位点dⅢ定点整合效率；F和I：分别为图E和图H灰度扫描值的柱状图展示结果(HDR效率=dⅢ灰度扫描值/T7 EndoⅠ灰度扫描值，=3)；J和K：分别为定点整合dⅢ识别序列至(图J)和(图K)基因位点的测序峰图。

表5 TA克隆数据统计

3 讨论

细胞所在的分裂期会显著影响DNA修复双链断裂途径的选择，在修复过程中，NHEJ可以发生在细胞分裂的任一时期，而HDR主要发生在S和G2期，李国玲等[17]通过同步化细胞周期至S和G2期，成功提高了基因组定点修饰的效率。Yang等[27]在人多能干细胞中添加ABT-751化合物，使细胞停滞在G2期，将2~5 kb片段整合至人基因组5个不同区域的效率提高了3~6倍；Lin等[28]添加aphidicolin和nocodazole，使人胚胎干细胞、成纤维细胞和293T细胞停滞在G2期，显著提高ssODN介导的定向修复效率。本研究结果显示，随着PD0325901浓度增加，处于G2期和S期的PFFs细胞群显著增加，处于G1期细胞群显著减少，细胞表现一定程度的同步化，与前人的报道结果不一致[29~31]。Wang等[30]研究表明，RAS-RAF-MEK-ERK信号转导通路通过激活MEK-ERK，促进细胞周期素D1 (cyclin D1)的表达及其与细胞周期依赖性激酶4 (cyclin-dependent kinase 4, Cdk4)的结合来调控细胞周期，促进细胞进入S期。Ayunadirah等[31]研究发现添加PD0325901显著降低了MDA-MB-231乳腺癌细胞的增殖，同时发现细胞周期停滞在G1期。本研究用MEK抑制剂PD0325901处理PFFs后，检测到S期细胞数量反而显著增加，推测可能是由于MEK通路受到抑制后影响其他平行信号通路调控细胞周期，或细胞种类差异导致结果不一致，但具体机理尚不明确。已有的研究表明，添加小分子化合物PD0325901使细胞同步至S期和G2期，其可能有利于提高定点整合效率[17,32~34]。本研究结果也显示，250 nmol/L浓度PD0325901能显著提高报告载体、和位点上ssODN介导的同源修复效率，表明将细胞周期同步化在S和G2期可以提高细胞定向修复效率。

NHEJ和HDR通路的激活需要许多关键因子的参与，它们能调节修复途径的选择，并在修复过程中发挥不可替代的重要作用[17,35,36]。本研究结果显示，不同浓度的PD0325901抑制剂均能提高报告载体、和位点上ssODN介导的同源修复效率，并表现明显剂量依赖性。本研究结果推测，PD0325901上调和的表达可能是提高同源重组效率的关键，但PD0325901添加剂量与上述因子表达并没有剂量依赖性关系，因而，二者间的相关性但仍需进一步研究。另外，PD0325901对NHEJ关键因子的表达也有不同程度的上调作用，尤其是25 nmol/L和250 nmol/L浓度影响较大，呈“U型效应”。在前人研究中也发现类似的现象，如Li等[17]在猪胎儿成纤维细胞中分别添加L755507、Resveratrol和Scr7 3种小分子抑制剂，NHEJ和HDR关键因子的表达水平出现了类似的“U型效应”。Kachhap等[37]在DU-145和LNCaP细胞中添加不同浓度梯度的丙戊酸(valproic acid, VPA)，基因的表达水平也同样出现类似的“U型效应”。产生“U型效应”的原因可能是小分子浓度过高时，出现负反馈调节，其具体调控机理还有待进一步研究。同时，本研究利用PD0325901提高ssODN介导的同源修复效率，证实了MEK抑制剂PD0325901对猪体细胞HDR效率具有促进作用，与前人报道PD0325901可提高ESC定点整合效率结果一致[15]。本研究通过向猪成纤维细胞培养基中添加MEK抑制剂使EGFP报告载体的同源修复效率显著提高了58.8%，使和26位点的同源重组效率分别提高了48.16%和17.64%，并表现较低的细胞毒性，这对提高PFFs细胞定向编辑效率及基因定向编辑猪的研究具有重要价值和意义。

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MEK inhibitor PD0325901 significantly boosts ssODN-mediated HDR efficiency in porcine fetal fibroblasts

Hao Ou1, Guoling Li1, Haoqiang Wang1, Guangyan Huang1, Gengyuan Cai1,2, Zicong Li1, Zhenfang Wu1,2, Xianwei Zhang1,2

There are two major pathways, homology-directed repair (HDR) and nonhomologous end joining (NHEJ), involved in double-strand break (DSB) repair.Single-stranded oligodeoxyribonucleotide (ssODN)-mediated homologous recombination repair is commonly used for animal site-directed genome editing, with great scientific and practical value. To improve ssODN-mediated HDR efficiency in the pig genome, we investigated the effect and molecular mechanism of mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase (MEK) inhibitor PD0325901 on the HDR efficiency in porcine fetal fibroblasts (PFFs). The results showed that PD0325901 obviously increased the percentage of G2and S phase cell populations and reduced the cell population ratio in the G1phase of PFFs, and promoted the expression of HDR repair factor. At the optimal concentration of 250 nmol/L, PD0325901 increased the repair efficiency of ssODN-mediated GFP reporter vector by 58.8% and the directed editing efficiency of PFFandlocus by 48.16% and 17.64%, respectively. The results show that MEK inhibitor PD0325901 significantly promotes the efficiency of ssODN-mediated homologous-directed repair in the porcine genome, thus offering a new idea to generate genetically modified pigs more effectively.

MEK inhibitor; homologous-directed repair (HDR); PD0325901; gene editing

2018-10-29;

2019-03-02

国家自然科学基金项目(编号：31772555)和国家转基因重大专项(编号：2016ZX08006002)资助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.31772555) and the National Transgenic Major Projects (No.2016ZX08006002)]

欧浩，硕士，专业方向：动物遗传育种。E-mail: 719367112@qq.com李国玲，博士，研究方向：基因编辑与遗传育种。E-mail: 792268184@qq.com欧浩和李国玲并列第一作者。

张献伟，博士，硕士生导师，研究方向：动物遗传育种。E-mail: zxianw@163.com

10.16288/j.yczz.18-294

2019/3/26 9:24:44

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20190326.0924.003.html

(责任编委: 任军)