肺隐球菌病标本在六胺银染色中的最佳温育时间

林倩，方庆全

（厦门大学附属第一医院病理科，厦门 361003）

隐球菌是广泛存在于自然界中的一种真菌[1]，肺隐球菌病是由新型隐球菌感染引起的慢性或亚急性肺部疾病[2]，该病由Sheppe于1924年首先报道[3]，由于临床症状缺乏特异性[4-6]，常被误诊为肺部炎症、结核、肿瘤等其他肺部疾病。肺活检组织病理学检查是确诊侵袭性肺部真菌感染的金标准[6,7]，理想的六胺银染色可将基底膜、真菌等阳性物质染成黑色[8,9]，有助于肺隐球菌病的病理诊断，但传统的六胺银染液步骤中采用水温箱60℃温育40～60min，作者实践发现该温育条件存在过染现象。为了寻求一种染色效果好、操作简便、染色时间短、污染少、染色方法可重复性高的六胺银染色方法，我们对最佳孵育时间进行了摸索。

资料与方法

1 标本

收集厦门大学附属第一医院病理科2017年1月—2017年12月确诊的30例肺隐球菌感染病例，每例病例选取最具代表意义的一个蜡块连续切片3张，厚度为4μm，不同蜡块为区组因素，将每个蜡块切取的3张切片简单随机化分为3组，每组1张，通过区组随机化将90张切片随机分为A、B、C 3组，烤片，常规脱蜡至水。

2 仪器

LEICA 2245切片机（德国莱卡），TY-7FB型生物组织摊烤片机（湖北孝感亚光医用电子技术有限公司），H.SWX-600BS电热恒温水温箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）。

3 试剂

1%高碘酸溶液； 5%铬酸水溶液； 2.5%草酸溶液；六胺银溶液配制：3%六次甲基四胺水溶液18ml，加入5%硝酸银水溶液2ml，再加入5%四硼酸钠溶液2ml，震荡至乳白色悬浊液变为清亮透明，加入22ml蒸馏水，混匀后放入已设置好的60℃水温箱温育5min；0.5%氯化金溶液； 2%硫代硫酸钠溶液；Harri苏木素染液；无水乙醇；二甲苯；中性树胶。

4 六胺银染色步骤

①1%高碘酸溶液10min，蒸馏水洗1次；

②5%铬酸水溶液40min，蒸馏水洗2次；

③2.5%草酸溶液1min，蒸馏水洗1次；

④放入在60℃水温箱温育的六胺银溶液中温育。其中，A组在六胺银染液中温育20～25min，B组在六胺银染液中温育30～35min，C组在六胺银染液中温育 40～45min。

⑤0.5%氯化金溶液30s，蒸馏水洗2次；

⑥2%硫代硫酸钠溶液5min，蒸馏水洗1次；

⑦Harri苏木素衬染5min；

⑧无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

5 观察指标及评价标准

切片由2名副主任医师进行双盲诊断，诊断为肺隐球菌病者为诊断准确。并对90张切片进行评分，评分采用十分制。10为满分，10分标准为：染色背景清晰，隐球菌呈现黑色，可以观察到隐球菌荚膜为空心透明，细胞核呈蓝色，周围肺纤维组织呈淡棕色至棕色；5项指标若有不同程度的缺陷，各逐减0.1-2分；每张切片得分0分为最低分。每组切片评分结果采用均数±标准差表示，每组切片的诊断准确率用百分率表示。

6 统计学分析

采用SPSS 18.0软件进行分析，计量资料采用独立样本t检验进行比较，计数资料率的比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 三组切片六胺银染色评分结果

A组六胺银染色得分（7.92±0.18分）显著低于B组（9.45±0.08分），差异有统计学意义（t=7.544，P＜0.01）；C组六胺银染色得分（8.30±0.17分）显著低于B组（9.45±0.08分），差异有统计学意义（t=6.031 ，P＜0.01）。

2 三组切片六胺银染色效果

A组：隐球菌呈棕褐色至浅黑色，细胞核呈蓝色，周围肺纤维组织呈淡蓝色至棕色，隐球菌与周围肺纤维组织染色对比不清晰（图1A）。B组：隐球菌染成空心黑色，细胞核呈蓝色，周围肺纤维组织呈淡棕色至棕色，隐球菌与周围肺纤维组织染色对比清晰（图1B）。C组：隐球菌呈团块状深黑色，少见黑色空心部分，细胞核与周围肺纤维组织呈棕褐色至黑色，隐球菌与周围肺纤维组织不易分辨（图1C）。B组染色效果高于A组与C组（图1）。

3 三组切片诊断准确率

A组切片诊断准确率为63.3%（19/30），显著低于B组（100%），差异有统计学意义（χ2=13.47，P＜0.01）；C组诊断准确率为83.3%（25/30），低于B组（100%），差异有统计学意义（χ2=5.45，P＜0.05）。

图1 六胺银染色温育时间比较。A，60℃孵育20～25min（A组）；B，60℃孵育30～35min（B组）；C，60℃孵育40～45min（C组）；比例尺，100μmFig. 1 Comparison for incubation time of periodic acid-silver metheramine staining. A, 20 to 25min at 60℃(Group A); B, 30 to 35min at 60℃ (Group B); C, 40 to 45min at 60℃ (Group C); scale bar, 100μm

讨 论

真菌又称霉菌，其种类较多，常见的致病菌有：毛霉菌、曲霉菌、新型隐球菌、放线菌和白色念珠菌。近年来，由于广谱抗生素、激素、化疗和免疫抑制剂的广泛使用，使人体的抵抗力下降，肺隐球菌病发病率有上升趋势[5-10]。且肺隐球菌病易被误诊为肺肿瘤[11]，因此肺活检组织病理学诊断的准确性显得尤为重要，这就更需要背景清晰、显色适当、对比度好的六胺银染色。

诸多的学者介绍传统的六胺银染色技术时，主张六胺银液60℃温育1～2h[12,13]。而有些学者采用各种办法来缩短六胺银液作用时间，如：翁秀琴等[14]将切片置于保湿盒内，滴上六胺银液后，置保湿盒于68℃烤箱里，在8min时切片直接置低倍镜下观察菌变化，当组织液呈现黄褐色，光学显微镜下见隐球菌时，用蒸馏水冲洗切片终止反应。冯家成等[15]采用光波变频微波辐射技术将六胺银液加热至65℃，将六胺银液作用时间缩短至10min左右。但贾云香等[16]研究发现，六氨银溶液水浴温度最好控制在58℃，稍高容易导致切片上过多杂质沉淀，背景不清晰。作者的实验也发现，切片在六胺银液60℃温育时，如果作用时间过长，也易造成过染，隐球菌与周围肺纤维组织不易分辨，背景不清晰。

六胺银染色是真菌染色的重要方法之一，传统方法中，在温育时间上给予的染色时间较为宽泛，一般为40～60min，甚至1～2h，且还需时时在显微镜下观察，操作繁琐，工作效率低下。作者实验发现，A组中六胺银染液染色时间过短，隐球菌尚未完全着色，染色过浅，与背景颜色相近，不易观察。此外，此时隐球菌隐约可见空心状，容易与红细胞混淆，影响诊断。B组中六胺银染液染色时间适中，隐球菌呈黑色空心状，空心部分为隐球菌的荚膜，不着色，也是隐球菌在六胺银染色中的一大特点。此时背景成淡蓝色，周围肺纤维组织呈淡棕色至棕色，与隐球菌形成鲜明的色差，容易观察。C组中六胺银染液染色时间过长，周围组织已经逐渐染成黑褐色，与隐球菌重叠、分界不清，隐球菌深染成团块状，少见空心部分，不易于观察，影响诊断。作者旨在通过实验，在原有六胺银染色方法的基础上，探索一种染色效果好、操作相对简便、染色时间较短、减少染液污染显微镜、染色方法可重复性高的六胺银染色方法。通过上述实验，作者发现B组的六胺银染色方法是最符合本研究初衷的技术方法。作者在实验过程中发现，B组的染色结果：隐球菌染成空心黑色，周围肺纤维组织呈淡棕色至棕色，隐球菌与周围肺纤维组织染色可谓对比清晰，但是，如果再将马松三色套染于B组的方法上，则隐球菌依然染成空心黑色，而周围肺纤维组织可能被染成绿色，如此将使周围肺纤维组织染色更加艳丽，与隐球菌染色对比更加清晰，更有助于肺隐球菌病的诊断。

综上所述，在用于诊断肺隐球菌病的病理切片行六胺银染色时，其他反应条件不变的情况下，六胺银染液作用步骤采用在水温箱60℃温育30～35min，染色评分结果得分高，效果好，肺隐球菌病诊断准确率高，且操作相对简便，染色时间较传统方法短，可减少染液污染显微镜，染色方法可重复性高，值得推荐。