基于反射光谱特征的肝组织热损伤动态分析*

赵金哲,王娟,晋晓飞,钱志余△,李韪韬，刘珈

(1.南京航空航天大学 自动化学院 生物医学工程系，南京 211106； 2.湖南省肿瘤医院/中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院，长沙 410013)

1 引 言

微波消融和射频消融作为两种主要的介入式微创热消融手段，已经成为早期肝癌的常用治疗方式[1]。肝癌消融治疗中，术中消融边界监控是实时评估消融疗效的主要方法之一[2]。由于生物组织热损伤取决于温度和时间两方面的因素，而目前以温度为主要参数的术中监测方法，无法从热损伤本质上反映出组织毁损程度，其评价指标往往依靠医生的经验来确定[3]。因此，寻找一种更加准确、灵敏的术中疗效评估手段是热消融治疗研究的重要方向之一。

近红外光谱技术是利用人体组织内不同物质在近红外波段吸收、散射等特性的差异来分析组织成分和功能的常用手段，具有简便、实时、无创或微创等技术优势[4]。应用近红外光谱技术进行消融损伤分析为消融手术实时疗效评估提供了一种便捷的解决方案。许多研究者针对肝组织热损伤前后的光谱变化进行了分析。Ritz等[5]对比了新鲜和消融凝固肝组织在400～2400 nm波段的吸收、散射特性差异；Lin等[6]和Buttermere等[7]分析了消融过程肝组织荧光光谱和反射光谱的变化，并采用特征峰值来反映组织热损伤进展；Yoshimura等[8]将反射光谱强度与热损伤动态过程相联系并分析了肝组织的热损伤参数；戴丽娟等[9]采用830～900 nm波段的反射光谱斜率来表征肝组织热损伤程度。前期研究中，我们也验证了以光谱分析方法推导得到的约化散射系数(Reduced Scattering Coefficient)来评估肝组织消融损伤程度的可行性，并以之测定了肝组织热损伤参数[10-11]。

上述研究表明，热损伤使肝组织产生的宏观光学特性改变较为明显，反射光谱强度或以之推导得到的评估参数与热损伤程度有密切关联。然而，以光谱分析方法来衡量不同物质的变性程度或识别损伤产物则更利于消融疗效评价。针对该问题，Spliethoff等[12]和Tanis等[13]采集了热损伤前后血液和肝肿瘤的近红外光谱，以光谱形状变化识别高铁血红蛋白(Methemoglobin)的产生，并以光谱导数特征峰的比值评价热损伤。但是，这种分析方式容易受到光谱斜率变化的影响，其评估参数对血红蛋白变性的动态过程表征不够连续。因此，如何在采用简便测量方法的同时动态分析组织主要物质的热损伤过程仍有待研究。

在现有研究基础上，我们采用近红外光谱技术分析肝组织热损伤过程中不同波长下反射光强的变化速率，并讨论了其在不同温度下的动态差异与组织血红蛋白热损伤进程的关联，以验证将其用于消融热损伤进程评估的可行性。

2 材料与方法

2.1 实验材料及实验系统组成

实验材料为当日获取的新鲜离体猪肝，均匀选取无较大血管的部分切成长约5 cm的条状并置于无菌试管中。实验采用恒温水浴方式对肝组织进行热致损处理，恒温水浴温度分别设置为60 ℃、70 ℃和80 ℃，每组实验重复1次以验证结果，共进行6次实验。为了保证实验结果的一致性，各组实验采用的样本均来自同一猪肝。

实验采用的光谱采集系统主要包含光纤光谱仪(USB2000，海洋光学，美国)、卤素光源(HL-2000，海洋光学，美国)和双光纤探头，其中双光纤探头由相同的两根单模光纤组成，芯径均为200 μm，中心间距为200 μm。温度监测采用自制测温探针，探针顶端内置热敏电阻(芝浦，日本)，测温针连接至单片机进行数据采集，经标准铂电阻校准后测温精度为±0.5 ℃。

实验系统组成见图1。实验前，将双光纤探头和测温针紧密并列，经试管橡皮塞插入猪肝中约7 cm并固定。将试管置入设定好温度的水浴锅中开始加热，同时开始记录光谱与温度数据变化。不同恒温水浴中保持时间分别为：60 ℃下加热10 min，70 ℃下加热8 min，80 ℃下加热6 min。达到时间后停止数据采集并取出试管。

图1 实验系统组成

2.2 数据采集与处理

光谱和温度采样频率为1 Hz，由计算机实时记录数据并处理。实验开始前，先采集光学白板的反射光谱作为参考光谱，记为R0(λ)，之后开始实验并保持光谱仪积分时间不变。参考光谱R0(λ)和实验采集的原始光谱Rraw(λ)采用低通滤波器去噪后，将Rraw(λ)与R0(λ)相除，以补偿卤素光源不同波长光强的差异：

(1)

为了分析不同波长λi处的反射光强在热损伤过程中动态变化速率的差异，将不同时刻t的R(t, λi)对所有加热时间归一化：

(2)

其中，NR(t, λi)为t时刻λi处归一化反射光强，min(R(λi))和max(R(λi))分别为热损伤过程R(λi)的最小值和最大值。因此，t时刻的归一化反射光谱为NR(λ)。由于不同波长处的反射光强与组织不同物质在该波长处的吸收和散射特性有关，其在热损伤过程的损伤程度与速率可能并不一致。因此，进一步将NR(λ)对波长求差分，可以分析各时刻不同波长反射光强的差异：

(3)

根据NR和ΔNR的变化,可以观察损伤过程中组织不同波段反射光谱的动态变化特性。同时，将NR与ΔNR变化速率出现差异的波长与不同血红蛋白的吸收峰值[14](图2)比较，可以进一步分析其与血红蛋白热损伤变性的关联。

3 结果与讨论

3.1 反射光谱变化

实验中组织反射光谱R的变化见图3，随着热损伤的产生，光谱强度逐渐增加。其中520～600 nm左右的波谷主要对应为血红蛋白的吸收。在所设定的三个加热温度下，加热结束时反射光谱的最大强度随温度增大，略有增加，不同波段光谱强度相对变化并不一致。

图2 含氧血红蛋白和脱氧血红蛋白的特征吸收谱

Fig2Characteristicabsorbancespectraofoxyhemoglobinanddeoxyhemoglobin

图3肝组织热损伤过程的反射光谱变化

Fig3Liverreflectancespectrumchangesduringthermaldamageprogress

3.2 反射光谱变化速率与热损伤动态分析

热损伤过程的归一化反射光谱NR见图4(a)，不同温度实验组中光谱变化速率不同。随着温度升高，光谱变化速率显著增加。60 ℃下NR在加热结束时达到最大强度，而70 ℃和80 ℃组短波段NR在达到最大值后略有下降，这可能是高温作用下吸光色团的进一步变性。各组实验中，同一时刻的NR曲面并不光滑，说明不同波长处的NR变化程度并不一致，这可以从光谱差分ΔNR的变化中明显观察到(见图4(b))。同组实验中，随着温度升高，ΔNR出现了明显的峰值变化，即不同波长下NR的变化速率开始出现差别。在70 ℃和80 ℃组中这一差别更加明显，且由于最高加热温度和升温速率的不同，ΔNR变化速率也不相同，80 ℃组中峰值变化更迅速。

这一结果可以由肝组织不同物质受热损伤速率的差异来说明。对某一波长处的反射光谱R(λ)来说，其强度取决于肝组织各种物质吸收和散射特性的叠加，当某一物质发生变性时，R(λ)也会随之改变。进一步，NR(λ)表达了整个热损伤过程中这一波长下反射光强的变化进程，其变化速率也决定于不同物质受热变性的速率的叠加。而对于具有不同光学特性的物质来说，以含氧血红蛋白(oxyhemoglobin, oxyHb)和脱氧血红蛋白(deoxyhemoglobin, deoxyHb)为例，若t时刻其对NR(λ)的影响分数分别表示为ωoxyHb(λ)和ωdeoxyHb(λ)，剩余浓度分别为CoxyHb(t)和CdeoxyHb(t)，则可以将NR(t,λ)写为：

NR(t,λ)=ωoxyHB(λ)·CoxyHB(t)+ωdeoxyHB(λ)·CdeoxyHB(t)

(4)

波长λ1和λ2处变化速率分别为:

(5)

图4 热损伤过程归一化反射光谱及光谱差分随时间的变化

(6)

因为NR对各个波长进行了归一化，对于不同波长λ1和λ2有:

ωoxyHB(λ1)+ωdeoxyHB(λ1)=ωoxyHB(λ2)+ωdeoxyHB(λ2)

(7)

因此，当oxyHb和deoxyHb的受热变性速率不一致，即dCoxyHb(t)/dt和dCdeoxyHb(t)/dt不相等时，dNR(t,λ1)/dt与dNR(t,λ1)/dt也不相等。若在某一波长处ωoxyHb(λ)显著大于ωdeoxyHb(λ)，则NR变化速率主要由oxyHb的热变性速率决定，反之亦然。

由式(4)至式(7)的分析可以看出，NR的变化反映了肝组织主要吸收色团(oxyHb和deoxyHb等)的变性速率差异和变性程度。为了分析各组实验中NR变化速率的差异与肝组织不同血红蛋白峰值的对应关系，将NR变化的等高线图与ΔNR峰值所在波长对应的变化曲线进行对照，见图5。从NR等高线图中可以看出，三组实验中，60 ℃组和70 ℃、80 ℃两组变化速率差别较大。与图2中oxyHb和deoxyHb的特征吸收峰对照可以发现，70 ℃组中578 nm、543 nm和80 ℃组中579 nm、536 nm的速率差对应oxyHb的吸收峰，556 nm处的速率差对应deoxyHb的吸收峰。而60 ℃组未达到oxyHb和deoxyHb发生明显热损伤变性的温度范围[15-16]，红细胞形态、肝组织细胞结构等变化间接引起oxyHb和deoxyHb对NR的影响，可能是该实验组569 nm 附近产生速率差的主要原因。此外，由于温度过高时高铁血红蛋白(methemoglobin, metHb)的产生，70 ℃和80 ℃组中621 nm和780 nm处的速率差可能由于metHb和deoxyHb吸收强度的相对变化引起[13, 17]。

不同温度下ΔNR随时间改变的曲线更加明显地反映了NR变化速率的差异。图4(b)中ΔNR的波峰、波谷所在波长值及该波长下的ΔNR变化见图5。三组实验中，70 ℃组和80 ℃组中ΔNR波峰和波谷所在的波长值相同，而60 ℃组则与之有所差别。60 ℃组中，随着温度升高，594 nm处ΔNR变化明显，其余各波长变化较小。70 ℃和80 ℃组中各波长ΔNR均呈先增后减的变化趋势，且80 ℃组由于温升速率较大，这种趋势随时间变化更加迅速。由于ΔNR变化与组织物质发生热损伤反应相关联，ΔNR明显变化的范围即反映了热损伤迅速进行的范围。当ΔNR达到最大值时，损伤反应速率达到最大值；当ΔNR减小并接近0时，该温度下损伤反应接近饱和。因此，通过ΔNR各峰值曲线的位置和变化速率能够准确判断热损伤进行的程度与变化趋势，并可以具体观察oxyHb和deoxyHb的热变性过程，从而避免了难以从反射光谱中直接辨别不同物质变性程度的缺点。

图5归一化反射光谱变化的等高线图及其差分特征峰随时间和温度的变化曲线

Fig5Contourofnormalizedreflectancespectrumandchangesofpeakvaluesofspectrumdifferentialovertimeandtemperature

4 结论

本研究采用近红外光谱技术，分析了不同温度下肝组织热损伤过程的反射光谱动态变化特征，并将这些动态变化特征与肝组织在可见-近红外波段的主要吸光物质，如oxyHb、deoxyHb的吸收光谱特征和热变性过程联系起来，从而以反射光谱动态变化速率上的差异来评估肝组织的热损伤程度。本研究采用的分析方法有助于利用近红外光谱技术区分组织不同物质的热损伤进程，并应用于消融治疗中消融边界的监测和消融疗效评估，从而提高消融手术的成功率。