茯苓菌种液体发酵条件及栽培基质优化分析

李作美，黄 奇

(蚌埠学院 食品与生物工程学院，安徽 蚌埠 233000)

茯苓属于真菌界，是一种食药两用的大型真菌，主要分布在安徽、湖南、河北、广西、河南等地[1-2]。茯苓含有多糖、氨基酸、有机酸、卵磷脂、胆碱、蛋白质、麦角甾醇、脂肪、多种酶和钾盐等，被誉为中药“八珍”之一，人体服用后有许多益处[3-5]。大量的古文记载了茯苓的食用和药用价值，茯苓具有利尿，降血糖，抗肿瘤作用，抗菌，提高免疫功能等[6-9]。

将茯苓菌种进行液体发酵是因为液体培养基的营养成分分布均匀，有利于营养体的充分接触和吸收，加速菌体生长[10-12]；液体菌种接种后具有流动快，易分散、发菌点多、萌发快等特点，能有效地降低培育过程中受到污染；可以工厂化生产并且不会受到季节性影响[13-15]。采用优化的液体菌种作为种子，直接用于出菇瓶或出菇袋，可使菌种生产周期大幅度缩短[16-18]。本研究对茯苓液体发酵条件进行优化，并筛选出最佳的菌丝长势的栽培基质配方。这为大量、高效地生产茯苓提供便利，为更好地研究茯苓菌种的生物活性奠定基础。

1 材料与方法

茯苓菌种bio-52338购于北京微生物菌种保藏中心；MRS培养基购于上海展云化工有限公司。

1.1 材料与仪器

仪器与设备主要有电热恒温培养箱LRH-250F，上海一恒科学仪器有限公司；立式双层智能精密型摇床BSD-YX2200，上海博讯仪器有限公司；离心机DT5-1B，北京时代北利离心机有限公司；立式电热压力蒸汽灭菌锅YM50Z，上海三申仪器设备有限公司；精密天平PA2204B，天津市泰斯特仪器有限公司；单人双面净化工作台0601568S，安徽省蚌埠市久禾净化技术有限公司；试管、锥形瓶、移液管、烧杯、量筒、棉花塞、玻璃棒、接种环、酒精灯等。

1.2 茯苓液体发酵的工艺流程

接种→活化→接种→摇瓶培养→发酵液离心→恒温烘干至恒重→精密天平秤重[12]。

1.3 茯苓菌种液体发酵条件的单因素试验

1.3.1 摇瓶转速不同对菌体干重的影响

取5个300 mL三角瓶分别装入150 mL液体培养基，接种量为6.25 mL，培养温度为25℃，将摇床转速分别置 80 r/min、110 r/min、140 r/min、170 r/min、200 r/min进行摇瓶培养7 d。培养好后取发酵液在6 000 r/min下离心15 min，收集沉积的菌丝球60℃烘干至恒重，用精密天平称重。

1.3.2 发酵时间不同对菌体干重的影响

取5个300 mL三角瓶分别装入150 mL液体培养基，接种为6.25 mL，培养温度为25℃，将其置于170 r/min的转速下进行摇瓶培养，培养时间分别设置为 7 d、8 d、9 d、10 d、11 d。待培养好后取发酵液在3 000 r/min下离心15 min，收集沉积的菌丝球60℃烘干至恒重，用精密天平称重。

1.3.3 接种量不同对菌体干重的影响

取5个300 mL三角瓶分别装入150 mL液体培养基，接种量依次按2%、4%、6%、8%、10%转化为体积分别为 3.06 mL、6.25 mL、9.57 mL、13.04 mL、16.67 mL，培养温度为25℃，将其置于170 r/min的转速下进行摇瓶培养7 d。取发酵液在6 000 r/min下离心15 min，收集沉积的菌丝球60℃烘干至恒重，用精密天平称重。

1.3.4 响应面法优化试验

分别选用摇瓶转速、发酵时间、接种量这三个因素（分别记为：A、B、C），进行三因素和三水平的响应面设计试验，以茯苓菌丝体的干重为测定指标，根据Design-Expert8.0.6统计软件对试验测定的值进行响应面回归分析[19]，因素水平见表1。

表1 中心组合设计试验因素水平

1.3.5 验证性试验

选择茯苓液体发酵所得菌丝干重最多的一组发酵条件进行验证试验、每组试验做三个平行，取其平均值。

1.4 接种最佳茯苓液体菌种的不同培养基质对菌丝生长、生物学效率的影响

分别选用草灰、玉米芯、米糠、豆粕及麦麸这5种主要栽培配料见表2，每一组配料混合均匀后作3个重复试验。每个菌袋内装干配料400 g，加水量为 55%，在 0.1 MPa、121℃条件下灭菌 50 min。待冷却至室温后每个菌袋中接种15 mL，放置于湿度为75%，温度为25℃无菌室内培养40 d，使其出菇。试验期间定期观察菌丝生长情况，测量菌丝生长速度，计算其生物学效率。试验数据采用DPS统计分析软件进行分析。

2 结果分析

2.1 茯苓菌种液体发酵条件对菌体干重的影响

2.1.1 摇瓶转速的不同对菌体干重的影响

由图1可知：菌体干重先随摇瓶转速的加快而增大，在170 r/min达到最大，然后随着-摇床转速的增加而减小。这可能是因为在一定温度条件下摇床转速越大，菌丝与液体培养基接触越充分，这使得菌体得到的营养越均匀丰富，菌体的生长就越旺盛，菌体的干重量就大，但转速过快则不利于菌体的生长。

2.1.2 发酵时间的不同对菌体干重的影响

由图2可知：培养时间在7～8 d时菌体生长旺盛，菌体干重增加，但超过8 d后，菌体生长减缓，甚至部分菌体逐渐趋于衰亡，菌体的干重随着培养时间的延长而减小。这可能是因为培养一段时间后，菌体生长所需营养成分逐渐耗尽的缘故。

表2 不同培养基质配方

图1 不同摇瓶转速对菌体干重的影响

图2 不同发酵时间对菌体干重的影响

2.1.3 接种量不同对菌体干重的影响

由图3可知：菌体干重先随着接种量的增大而增大，在6.25 mL处达到最大，然后随着接种量的增大而减小。这可能是因为接种量越多，菌体生长越快，菌体干重就越多，但接种量过多，菌体生长所需的营养成分就处在供不应求的状态，导致菌体生长较慢，从而菌体的干重就会减少。

2.1.4 响应面实验的优化

图3 不同接种量对菌体干重的影响

Box-Behnken试验设计及茯苓菌体干重的测得结果如表3所示。

使用响应面法分析实验结果，得到不同条件下茯苓菌体干重的线性回归方程：

发酵后的茯苓菌体干重=0.073-3(A+B+C)-1.167E-3(AB-AC-BC-A2)-0.011B2-0.014C2。

式中A为摇床摇瓶转速，单位：r/min；B为菌体发酵时间，单位：d；C为液体菌种的接种量，单位：mL。E是通过响应面分析法得到的线性回归方程时自动生成的。

对这个模型进行方差分析和对模型系数进行显著性检验，分析和检验结果如表4。根据表4可知，P＜0.05表示的是这项指标是显著的，P＜0.01表示的是这项指标极为显著性。P＞0.1000的值表明的是这项指标不是显著的[25]。由表4可以知该模型拟合度良好，与实际情况能较好的吻合，试验误差小，R2=0.996 5，R2Adj=0.990 3，说明理论最大值是存在的，可用这个模型和方程来分析茯苓液体发酵的最优条件[20]。

表3 Box-Behnken试验结果

2.2 响应面曲面的设计和分析

响应面曲面图是根据线性回归方程制作的，是在各个实验因素中使其中一个因素不变，而使另外两个因素改变，并且使它们相互作用，其结果可以推测和验证响应值以及确定变量之间的相互关系[21]。分析当摇瓶转速、茯苓菌种培养时间及其接种量三个因素中，固定其中有一个因素，改变另外两个因素的交差相互作用对茯苓液体发酵的影响。根据回归方程制作出模型的响应曲面，等高线图的形状可以反映出两因素交互作用的强弱和显著程度[22]，见图4～6。

由图4可知，响应曲面陡峭，表明摇瓶转速和发酵时间的交互作用对菌体干重的影响较大，从等高线形状可以看出，摇瓶转速对菌体干重的影响要大于发酵时间对菌体干重的影响[23]。

由图5可知，响应曲面陡峭，表明摇瓶转速和接种量的交互作用对菌体干重的影响较大，从等高线形状可以看出，摇瓶转速对菌体干重的影响要大于接种量对菌体干重的影响[24]。

由图6可知，响应曲面陡峭，表明发酵时间和接种量的交互作用对菌体干重的影响较大[25]，从等高线形状可以看出，发酵时间对菌体干重的影响要大于接种量对菌体干重的影响。

2.3 验证试验结果

考虑到工艺的可行性和操作的方便性，在25℃、150 mL液体培养基中培养7 d，摇床转速为177 r/min,培养天数为8 d，接种量为6.62 mL做三组平行试验，测得的试验结果如表5所示。

由表3可计算得平均数值为0.074g，符合响应曲面的优化试验结果。

表4 回归模型系数的显著性检验结果及方差分析

图4 摇瓶转速与发酵时间的响应面图和等高线

图5 接种量与摇瓶转速的响应面图和等高线

图6 接种量与发酵时间的响应面图和等高线

表5 菌体干重的验证实验

2.4 不同培养基质对菌丝生长和生物转化率影响

培养基质是影响茯苓菌丝生长的重要因素，如表6所示的8组不同的培养基质在同一条件下菌丝的长势和生物学效率的测定情况。在培养基质1和4中菌丝长势较弱，在培养基质7和8中长势最强，其中培养基质7的生物学效率达到64%。

表6 不同培养基质对菌丝生长和生物转化率的影响

3 小结

在单因素检测分析基础上，用响应面分析茯苓液体发酵的最优条件。根据响应面二次回归模型计算得到茯苓液体发酵最佳条件为：以150 mL液体培养基进行培养，摇床摇瓶转速177.07 r/min，培养天数为8.17 d，接种量为6.62 mL，为了工艺可行性，将茯苓液体发酵条件数据修改为：摇床摇瓶转速为177 r/min,培养天数为8 d，接种量为6.62 mL。经试验验证该工艺条件切实可行，可以应用。