铁皮石斛内生真菌分离鉴定及生物活性研究

蒋彦洁

寄生在健康植物各种组织和器官内部或细胞间隙中部分或全部生活周期的一类真菌被称之为植物内生真菌（Endophytefungus），其不会造成宿主明显的病理症状[1]。根据内共生理论，内生真菌与宿主可能具有相同或相似的次生代谢产物[2]。由于许多具有抗肿瘤活性的天然产物已从植物的内生真菌中分离得到，再加上真菌的来源广，从真菌切入，来开发抑菌及抗肿瘤药物在当前比较流行[3]。铁皮石斛的抗肿瘤功效良好，部分品种还能起到杀虫消炎效果[4]。另外，植物内生真菌的分布和其生长地域密不可分。因此本项目通过分离浙江地理种源的铁皮石斛中的内生真菌，并筛选其抑菌及抗肿瘤活性，以期获得高效低毒的抑菌抗肿瘤活性物质。

1 供试材料与仪器

1.1 材料

野生铁皮石斛采自浙江地理种源，大肠杆菌、枯草芽包杆菌、金色葡萄球菌、人胃癌MKN45细胞，由浙江中医药大学提供。

1.2 试剂与仪器

PDA、MS、LB培养基，PBS缓冲液（pH值7.4），细胞冻存液；0.25%膜蛋白酶，0.02%EDTA购自杭州四季青公司；胎牛血清、高糖DMEM培养基购自吉诺生物医药技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯：354型酶标仪（生产商：Thermo公司）；IX70倒置相差显微镜（生产商：Olympus公司）。

2 研究方法

2.1 活性菌株的分离

内生真菌的分离：将野生铁皮石斛洗净，并分别将根、茎、叶切成小片（0.5 cm），消毒方法参照严亮等[5]报道的方法。

2.2 抑菌活性筛选（抑菌实验）

指示菌培养为实验室自己培养，抗菌活性的初选应用杯碟法、菌饼法、纸片法测定。而抑菌活性菌株的复选是通过纸片扩散法来实现对活性菌株发酵液的抑菌活性的检测。

2.3 抗肿瘤活性筛选

2.3.1 肿瘤细胞的培养与内生真菌抗肿瘤活性的测定 采用体外细胞毒活性测定的MTT法测定菌体粗提物或发酵液粗提物的抗肿瘤活性。取对数生长期的肿瘤细胞。用胰蛋白酶消化后，用完全培养基制成细胞悬浮液，血球计数板计数，随后取80 µL接种于96孔板，按每孔5 000～8 000个细胞接种，留两孔做空白对照。置于5%CO2，37℃培养箱中培养1 d后，加入20 µL经完全培养液稀释的样品（阴性对照组加20 µL培养液，空白组加入100 µL的培养液，每个样品做3个重复），继续培养2 d后取出，吸弃培养基，每孔加入2.5 µg/µL的MTT溶液20 µL，37℃反应4 h后，每孔再加100 µL DMSO，37℃溶解30 min；用酶标仪测量各孔吸光值（测量波长为570 nm）并计算抑制率。

2.3.2 活性物质对荷瘤小鼠抑瘤试验 将接种后的小鼠随机分组，活性物质设不同剂量以及生理盐水组、阳性药组，每组10～12只。之后继续腹腔注射给药（1次/d，共8 d），将小鼠的生存状况和体质量记录下来。实体瘤模型实验组在最后给药的第二天将其处死，剥离瘤块称其体质量，并计算抑瘤率。

2.4 活性菌株的鉴定[6-7]

2.4.1 内生真菌形态特征观察 在显微镜下，观察内生真菌的菌落、菌丝和孢子等特征，参照《真菌鉴定手册》和《现代医学真菌鉴定手册》进行鉴定。

2.4.2 ITS序列系统发育分析 用真菌通用引物ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），经PCR技术，扩增出真菌基因组的rRNA基因内部转录间隔区（ITSs）。将PCR产物纯化后测序。

3 结果

3.1 分离结果

共从采自浙江地理源的野生铁皮石斛的根、茎、叶中分离出27株内生真菌，其中11株（40.74%）从根中分离出，茎中分离出9株（33.33%），叶中分离出7株（25.93%）。

3.2 内生真菌的抑菌活性

平板对峙实验结果显示，有7株有抑菌作用（至少对1种对指示菌，抑菌圈直径大于7 mm），具体见表1。

表1 内生真菌的抑菌活性

3.3 内生真菌发酵产物的抑菌活性

上述7株内生真菌的发酵产物醋酸乙酯萃取相也显示出了不同程度的抑菌活性。见表2。

表2 内生真菌发酵产物的抑菌活性

3.4 代谢产物醋酸乙酯部分体外抗肿瘤活性

7株菌株代谢产物的醋酸乙酯萃取对HepG2的增殖也产生了不同的抑制作用，见表3。

表3 代谢产物醋酸乙酯部分体外抗肿瘤活性

表4 内生真菌的菌落形态特征

表5 内生真菌所属菌属鉴定结果

3.5 内生真菌的菌落形态特征和所属菌属鉴定结果

所分离的内生真菌的菌落形态特征和所属菌属鉴定结果具体见表4和表5。

4 讨论

植物的组织基本上都存在内生真菌，其种群十分庞大（约有1.5×106种）[8]。植物内生真菌的代谢产物不仅丰富且多具有一定的活性：如调节植物生长、抑菌、杀虫、抗肿瘤等[9-10]。叶子等[11]报道，短叶红豆杉（Taxusbrevifolia）的韧皮部分离到的内生真菌Taxomycesandreanae可产生与宿主相同的抗肿瘤代谢产物紫杉醇，国内外的研究者相继从植物内生真菌中分离到多种可产生抗肿瘤活性的天然产物，考虑到真菌的来源广，其生产可通过发酵、菌种选育或改进和控制发酵工艺等方式来实现将所需化合物的含量提高的目的，同时这又不会将生物资源大量破坏[12]。因此，从真菌中切入，来研究开发抑菌及抗肿瘤药物，前景较为广阔。

铁皮石斛（dendrobium candidum）属微子目，兰科多年生附生草本植物，具有生津、降血糖、增强机体免疫力等作用，鉴于铁皮石斛具有良好的抗肿瘤功效及一定的杀虫消炎作用，相信它们的内生真菌也具有产生与其宿主相同或相似的活性物质。另外，内生真菌的分布与宿主物种有关，也与地域有关系。

本实验结果显示，在浙江地理源的铁皮石斛中共分离出27株内生真菌，其共归属10个属。抑菌实验表明有7株有抑菌作用（至少对1种对指示菌），其代谢产物的醋酸乙酯萃取相也有抑菌和抗肿瘤效果。

综上所述，铁皮石斛内生真菌具有丰富的种群，将其分离后可发挥潜在的抑菌和抗肿瘤活性，为抑菌和抗肿瘤候选药物的开发提供思路。