不同产地白及野生品与栽培品质量比较研究

周海婷,陈志敏,4,赵永峰,权 亮,张 希,李文兵,胡昌江,2*

(1.成都中医药大学,四川 成都611137；2.国家中医药管理局“中药配方颗粒质量与疗效评价”重点研究室,四川 成都611900；3.四川新绿色药业科技发展有限公司,四川 成都611900；4.成都市中草药研究所,四川 成都610016)

白及始载于《神农本草经》[1],为兰科植物白及Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.的干燥块茎,具有收敛止血、消肿生肌的功效,临床上用于治疗结肠炎[2]、抑制变性链球菌、防龋齿[3]。白及不仅药用价值高,而且极具观赏价值,是我国现代医药工业和化妆品工业的重要原材料[4]。近年来白及的用药需求急剧增加,但白及种子非常细小且无胚乳,因此在自然条件下主要靠一分为二的分株繁殖,形成规模需要10年甚至更长时间[5]。近年来,由于生态环境的破坏和市场需求的加大,白及价格从2006年开始出现快速增长,2009年下半年至2012出现暴涨,如2012年人工种植白及的市场价达到每公斤140元左右,而野生白及的价格则高达每公斤1 200元。因此,人工栽培白及以替代野生白及已经成为必然趋势。

目前,学术界对于人工栽培白及的品质缺乏系统性研究,不同程度上影响了人工栽培白及的推广应用。因此,本研究从性状、鉴别、水分、灰分、多糖含量、浸出物含量和1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯(militarine)含量及5种微量元素等方面,对野生与栽培白及进行质量分析,比较二者差异,为栽培白及的推广应用提供参考。

1 材料与试剂

1.1 材料收集

本研究总共收集了8个省20批供试品白及样品；其中野生10批,栽培10批,均经成都中医药大学卢先明教授鉴定为兰科白及属植物白及Bletilla Striata(Thunb)Reichb.f.的干燥块根茎。将样品粉碎,过5号筛备用。样品详情见表1。

1.2 仪器与试剂

岛津LC-2030高效液相色谱仪(日本岛津公司)；BP211D电子天平(感量0.01 mg)；BS200S电子天平(感量0.001g),德国Sartorius公司；超声波清洗器KQ-600DB(昆山市超声仪器有限公司)；箱式电阻炉；电热恒温鼓风干燥箱；半自动点样仪；紫外可见分光光度计；高通量消解仪；电感耦合等离子体质谱仪。

1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯(militarine)对照品(批号17110623,上海同田生物技术有限公司提供)。乙腈为色谱纯；怡宝纯净水；优级纯硝酸；铜、砷、镉、汞、铅标准储备液均购自国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院(规格50m L,1 000μg/m L)；其他试剂均为分析纯。

表1 白及样品信息

2 方法与结果

2.1 性状测定

通过直接观察法观察白及的颜色,并用游标卡尺测量白及的长宽。结果见表2和图1。

表2 野生白及与栽培白及性状对比

图1 野生白及与栽培白及

2.2 薄层鉴别

按2015年版《中国药典·白及》相关薄层鉴别方法进行测定。见图2和图3。

图2 野生白及样品薄层图谱

图3 栽培白及样品薄层图谱

2.3 水分、灰分测定

精密称取白及粉末2g,按《中国药典》2015年版第4部(附录0832)“水分测定法”中的“烘干法”进行测定。

精密称取白及粉末2g,按《中国药典》2015年版第4部(附录2302)“灰分测定法”进行测定。

2.4 浸出物含量测定

取供试品2g,精密称定,置250m L锥形瓶中,加稀乙醇50 m L,密筛,称定重量,静置1 h后,连接回流冷凝管,加热至沸腾,并保持1 h,放冷后,取下锥形瓶,密筛,再次称定重量,用稀乙醇补足减失的重量,摇匀,用干燥滤器滤过,精密量取25 m L,置已经干燥至恒重的蒸发皿中,在水浴蒸干后,于105℃干燥5h,置干燥器中冷却30 min,迅速精密称定重量。

2.5 多糖含量比较

2.5.1 试液配制 (1)0.2%蒽酮-硫酸溶液的配制：精密称取蒽酮0.2 g,加80%硫酸溶液100 m L使溶解,摇匀即得(棕色瓶保存或临用时配制)。

(2)对照品溶液配制：精密称取D-无水葡萄糖对照品0.01053g,置100 m L容量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,即得对照品溶液(D-无水葡萄糖对照品使用以99.5%计,即每1 m L中含无水葡萄糖0.1044 mg)。

(3)供试品溶液配制：取白及样品1粉末约0.5 g,精密称定,置圆底烧瓶中,加入150m L水加热回流提取1h,趁热用布氏漏斗滤过,残渣及烧瓶用热水洗涤4次,每次10 m L,合并滤液和洗液,放冷,转移至250 m L量瓶中,加水至刻度,摇匀,溶液滤过,精密量取续滤液0.5 m L加入4 m L丙酮,摇匀,静置10 min,离心,倒去上清液,沉淀加水溶解,转移至10 m L量瓶中,加水至刻度,摇匀,即得。

2.5.2 显色条件确定 精密量取D-无水葡萄糖对照品溶液0.2m L,置10m L具塞试管中,加水至2m L摇匀；供试品溶液2 m L,置10 m L具塞试管中。冰水浴中缓缓滴加蒽酮-硫酸溶液6 m L,摇匀,沸水浴10 min,冰水浴10 min,以相应试剂为空白,625 nm波长下测量吸光度。见图4。

图4 白及全波长扫描

2.5.3 线性关系考察 分别量取0.284 mg/m L的D-无水葡萄糖对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.5、0.8m L于10m L具塞试管中,加水至2 m L,摇匀,在冰水浴中缓缓滴加6 m L 0.2%蒽酮-硫酸溶液,摇匀,沸水浴10min,冰水浴10 min,在625 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标Y,葡萄糖浓度为横坐标X,所得标准曲线为：Y=6.3732X-0.0464,R2=0.9983。

2.6 militarine含量测定

2.6.1 色谱条件 色谱柱：Inertsustain C18(250 mm×4.6 mm,5μm),检测波长223 nm,柱温40℃,流速1.0 m L·min-1,进样量10μL,流动相甲醇-水(63∶37)。

2.6.2 对照品溶液制备 精密称取militarine对照品适量,加甲醇溶液制成每1m L含0.813mg对照品的溶液。

图5 对照品及样品图谱

2.6.3 供试品溶液的制备 取本品粉末0.2 g,精密称定,精密加入甲醇50 m L,称重,加热回流2 h,放冷,用甲醇补足减失重,摇匀,滤过,取续滤液作为供试品溶液。对照品及样品图谱见图5。水分、灰分、浸出物、多糖、militarine含量对比见表2及图6。

表2 野生白及和栽培白及比较

图6 野生白及和栽培白及比较

2.6.4 线性关系考察 精密称取militarine对照品,加甲醇制成每1 m L含0.8130 mg对照品的储备液,分别精密量取对照品储备液0.2、0.5、1、2、4 m L置5 m L量瓶中,分别加甲醇溶液稀释至刻度,摇匀。分别精密吸取10μL储备液,注入液相色谱仪,以峰面积(Y)为纵坐标,进样浓度(X)为横坐标,绘制工作曲线计算回归方程：Y=107X+18453,r=0.999 9。结果表明militarine进样量在0.32～6.37μg间线性关系良好。

2.6.5 精密度试验 精密称取同一批白及粉末0.2 g,按“2.5.3”项下方法制备白及供试品溶液,并按“2.5.1”项下色谱条件,连续重复进样6次,测定峰面积。militarine的峰面积RSD为0.19%,显示仪器精密度良好。

2.6.6 重复性试验 精密称取同一批白及粉末6份,各0.2g,按 “2.5.2”项下方法制备白及供试品溶液,并按“2.5.1”项下色谱条件进样,测定峰面积。结果militarine含量的RSD为0.70%,表明重复性良好。

2.6.7 稳定性试验 精密称取同一批白及粉末0.2 g,按“2.5.2”项下方法制备白及供试品溶液,并在“2.5.1”项下色谱条件分别于0、1、2、4、8、12 h进样,测定峰面积。结果militarine峰面积RSD为0.28%,结果表明白及供试品溶液在12 h内稳定。

2.7 铅、砷、镉、汞、铜五种元素的含量测定

2.7.1 标准品储备溶液的制备 精密量取铅、砷、镉、汞、铜单元素标准溶液,用10%硝酸溶液稀释制成每1 m L分别含铅、砷、镉、汞、铜元素1μg、0.5μg、1μg、1μg、10μg的溶液。

2.7.2 标准品溶液的制备 精密量上述储备液,用10%硝酸溶液稀释,制成每1 m L含铅、砷0 ng、1 ng、5 ng、10 ng、20 ng,含镉0 ng、0.5 ng、2.5 ng、5 ng、10 ng,含铜0 ng、50 ng、100 ng、200 ng、500 ng的系列浓度混合溶液。另取汞储备液,用10%硝酸溶液稀释制成每1 m L分别含汞0 ng、0.2 ng、0.5 ng、1 ng、2 ng、5 ng的溶液。

2.7.3 内标溶液的制备 精密量取锗、铟、铋单元素标准溶液适量,用水稀释制成每1m L含锗、铟、铋元素1μg的混合溶液。

2.7.4 供试品溶液的制备 精密称定白及粉末约0.2 g,加硝酸6m L消解,消解完全后冷却至60℃,消解液转入50 m L量瓶中,用少量水洗涤消解罐,合并于量瓶中,加入金单元素标准溶液(1μg/m L)200μL,摇匀,即得。

2.7.5 样品测定 线性回归方程见表3。野生白及和栽培白及铅、砷、镉、汞、铜5种元素的含量范围及均值见表4。用SPSS21.0软件对野生和栽培白及5种元素含量进行独立样本t检验,结果见表6。由表6知,除铜元素外,其他4种元素在野生和栽培品中没有显著性差异。

表3 白及五种元素回归方程和相关系数

表4 白及5种微量元素含量对比 (mg/kg)

3 结论

本研究以入药部位白及块茎为研究对象,比较了野生白及和栽培白及的性状、薄层鉴别、水分、灰分、浸出物、多糖和militarine含量、微量元素等几方面的内容,发现由于生长环境不同,白及性状有一定差异,本研究为以后的药材鉴别提供了依据。野生白及的水分、灰分、militarine含量高于栽培白及,而浸出物、多糖含量值低于栽培白及,二者水分、灰分均符合药典要求。在多糖含量方面,野生品低于栽培品,多糖是白及中主要成分,对于血液系统、消化系统、免疫系统、抗肿瘤和抗菌都有良好的药效,因此在多糖含量方面栽培品可以替代野生品。本研究比较了热浸法、冷浸法以及不同浓度乙醇(50%、70%、80%)测定白及浸出物的效果,结果热浸法和冷浸法均不能过滤,50%乙醇浸出物含量18.9%,70%乙醇浸出物含量11%,80%乙醇浸出物含量12.6%,所以最后采用50%乙醇进行浸出物测定。在白及块茎中含有的微量元素,依据含量排名：Cu＞Pb＞As＞Cd＞Hg,说明白及块茎对Cu的富集能力最强,对汞的富集能力最弱,二者有显著性差异。所以在栽培时应注重栽培条件,减少含Cu农药和肥料的使用。本课题通过对野生和栽培白及进行多项研究,为合理保护野生白及资源,加强白及栽培技术的推广,开展白及的野生资源保护提供了重要参考依据。

表5 5种微量元素独立t检验