生物有机肥对不同连作年限设施黄瓜土壤微生物数量和酶活性的影响

王燕云，赵龙杰，郝春莉，蔡尽忠，*

(1.厦门华厦学院 检验科学与技术系，福建 厦门 361024； 2.厦门市环境监测工程技术研究中心，福建 厦门 361024)

我国是世界上最大的设施蔬菜种植国家[1]。受生产栽培条件限制及经济利益驱使，设施内蔬菜种植种类单一，连作现象普遍存在。黄瓜作为一种重要的瓜类蔬菜，其栽培面积约占设施栽培总面积的 60%。设施黄瓜连作导致土壤质量下降，黄瓜生长势变弱、产量降低、品质下降、病虫害严重。这已成为制约设施黄瓜可持续发展的瓶颈问题。设施黄瓜连作障碍的防控技术包括嫁接[2]、土壤消毒[3]、轮作[4]、生物有机肥[5]等。其中，嫁接技术和土壤消毒技术烦琐且成本高，轮作并不适合各蔬菜基地单一品种的趋向。生物有机肥作为一种缓解连作障碍的措施，不仅成本较低，而且应用方便。

土壤微生物和土壤酶是土壤生态系统的重要组成成分，是评价土壤生态质量的重要指标。土壤微生物是土壤生化反应的推动者和参与者，是土壤有机无机复合体的重要组成部分，被认为是表征土壤质量变化最敏感、最有潜力的指标[6]。土壤酶活性在土壤养分循环中起着重要作用，体现了土壤总的生物学活性，表征了土壤的综合肥力特征及土壤养分转化进程，可以作为衡量生态系统土壤质量变化的预警和敏感指标[7]。

木霉菌是一种广泛用于植物病害生物防治和改善作物生长的丝状真菌，能够增加作物产量和品质，还能改良土壤[8]。北虫草为冬虫夏草同属药用真菌，其人工栽培目前以小麦、大米、小米或高粱作为养分来源。规模化人工栽培北虫草，子实体采收后剩下的培养基数量很大，且营养丰富，有很大的开发空间。古龙酸母液是维生素C(VC)二步发酵过程中产生的酸性废弃液，含有丰富的低分子量有机酸，能够改善土壤质量[9]。北虫草废弃培养基和古龙酸母液产量很大，目前尚无高效的处置方法，将其排放于环境中既造成环境污染又浪费资源。

本研究利用木霉菌、北虫草废弃培养基、古龙酸母液通过堆肥制备了一种生物有机肥，经过前期试验，发现其对设施土壤具有显著的改良效果。将此生物有机肥施用于不同连作年限的设施黄瓜土壤，通过测定土壤微生物数量、酶活性、黄瓜产量和黄瓜品质指标，揭示生物有机肥对连作黄瓜土壤生态质量和产量的影响，为指导平衡施肥与土壤养分管理奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

深绿木霉菌由中科院微生物研究所菌种库提供。北虫草废弃培养基取自河南省濮阳市北虫草培养基地。古龙酸母液取自石药集团。生物有机肥由深绿木霉菌、废弃培养基、古龙酸母液按菌料比(质量比)1∶250∶250添加，调节含水量至50%，pH调至6.5，搅拌均匀后，堆成高约1 m的金字塔形，堆肥开始每5 d翻堆一次，堆肥30 d时，堆肥腐熟。该生物有机肥呈褐色粒状，无恶臭，有机质含量为49.88%，总N含量为2.80%，P2O5含量为2.28%，K2O含量为0.58%，水分含量为18.56%，pH值6.62，总As含量为3.15 mg·kg-1，总Hg含量为0.77 mg·kg-1，总Pb含量为18.14 mg·kg-1，总Cd含量为0.45 mg·kg-1，总Cr含量为33.47 mg·kg-1。这些指标皆符合我国农业行业有机肥料标准(NY 525—2012)。

1.2 盆栽试验

2017年5月以盆栽方式进行生物有机肥的施肥试验。试验土壤取自山东省寿光市孙家集镇大棚连片区0—20 cm根区耕层，包括4种土壤：未连作土壤(设施周边玉米-辣椒轮作土壤)，以及连作3、7、11 a的设施黄瓜土壤(同一蔬菜和同一管理水平)，4种土壤的养分含量如表1所示。生物有机肥的施用量包括4个水平：未施肥、低用量(7.5 t·hm-2)、中等用量(15 t·hm-2)、高用量(30 t·hm-2)。试验共设置16个处理，每个处理6个重复。盆栽时，每盆中放入1.5 kg土壤，均匀撒入大小一致的5粒黄瓜种子，当黄瓜幼苗株高为10 cm时，每盆间苗至3株，至黄瓜株高达50 cm时，每盆最终留苗1株。在黄瓜培养期间保持各盆土壤水分含量为田间持水量的60%。记录每盆的黄瓜产量，盛果期每个处理取6个代表植株的代表性果实测定黄瓜品质指标(VC、可溶性蛋白质、可溶性糖含量)，同时分别采集盆中土壤，过2 mm筛，测定土壤微生物数量和酶活性。

表1供试土壤养分特征

Table1Nutrients property of test soils

连作年限Continuouscropping year/a有机质Organic matter/(g·kg-1)总氮Total N/(g·kg-1)总磷Total P/(g·kg-1)总钾Total K/(g·kg-1)速效氮Available N/(mg·kg-1)速效磷Available P/(mg·kg-1)速效钾Available K/(mg·kg-1)023.650.810.721.1327.5824.3129.09325.180.890.811.1931.3445.1852.47732.761.121.051.3254.7938.7641.551142.151.461.381.5748.2732.3434.02

1.3 测试方法

VC含量采用2，6-二氯靛酚滴定法测定，可溶性蛋白质含量采用考马斯亮蓝G-250染色法测定，可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定[10]。土壤微生物数量采用平板计数法[11]：细菌计数采用牛肉膏蛋白胨培养基，真菌计数采用马丁氏培养基，放线菌计数采用改良高氏一号培养基，木霉菌计数采用木霉菌选择性培养基(TSM)，尖孢镰刀菌计数采用尖孢镰刀菌分离培养基(PEA)[12]。土壤蔗糖酶活性采用二硝基水杨酸比色法测定[13]，磷酸酶活性采用对硝基苯磷酸盐法测定[11]，过氧化氢酶活性采用滴定法测定[14]，脲酶活性采用次氯酸钠比色法测定[15]。

1.4 数据分析

为了总体评价生物有机肥对连作设施土壤质量的修复效果，消除土壤微生物数量和酶活性量纲不同对土壤质量总体评价的影响，参考王兵等[16]和杨长明等[17]评价土壤综合质量的方法，采用隶属度评价土壤质量。

所有土壤指标数据均在土壤烘干(105 ℃)质量的基础上进行计算。所有的试验数据应用SPSS 17.0软件进行方差分析，用Excel 2010制图。

2 结果与分析

2.1 对连作黄瓜产量和品质的影响

如图1所示，从连作年限的角度分析，在不施生物有机肥的条件下，当连作年限从0增长到3 a时，黄瓜产量和黄瓜可溶性糖含量无显著差异，黄瓜VC含量却呈现显著(P<0.05)差异；当连作年限从3 a延长到7 a或11 a时，黄瓜产量及黄瓜可溶性糖含量显著(P<0.05)下降，但与未连作的处理相比并无显著差异，连作11 a处理的黄瓜VC含量显著(P<0.05)低于连作3 a处理的黄瓜，但与连作7 a处理的黄瓜并无显著差异。在施用低量生物有机肥的条件下，当连作年限从0增长到3 a时，黄瓜VC含量无显著差异；当连作年限从3 a延长到7 a或11 a时，黄瓜VC含量显著(P<0.05)下降。在施用中、高量生物有机肥的条件下，不同连作年限处理的黄瓜产量，以及黄瓜VC、可溶性糖含量均无显著差异。在施肥量相同的条件下，不同连作年限下黄瓜可溶性蛋白质含量始终无显著差异。可以看出，黄瓜产量和品质总体在连作3 a处理下尚无明显负面影响，但随着连作年限的继续延长开始降低，表明设施黄瓜存在着严重的连作障碍问题。

从生物有机肥施用量的角度分析，相同连作年限下，黄瓜产量和品质指标均随着施肥量的增加而增加，高用量下的黄瓜产量，以及VC、可溶性糖含量均显著(P<0.05)高于不施用生物有机肥的处理。相同连作年限下，不同生物有机肥用量处理的黄瓜可溶性蛋白质含量同样无显著差异。可以看出，高用量生物有机肥可明显提高长期连作黄瓜的产量和品质。

2.2 对连作土壤微生物数量的影响

如图2所示，从连作年限的角度分析，随着设施黄瓜连作年限的增加，土壤细菌、放线菌、木霉菌数量总体呈现先增加后逐渐降低的趋势，在连作3 a时达到峰值；土壤真菌数量总体持续缓慢增加；土壤尖孢镰刀菌数量在连作3 a以前缓慢增长，之后总体呈现急剧增长的趋势。以上结果表明，在连作3 a以内，土壤的生态质量尚无明显劣化，当连作年限进一步延长，随着病原真菌——尖孢镰刀菌数量的急剧增长，土壤生态环境急剧恶化。

柱上无相同小写字母的表示同一连作年限不同施肥量处理间存在显著差异(P<0.05)，无相同大写字母的表示同一施肥量不同连作年限处理间存在显著差异(P<0.05)。Bars marked without the same lowercase letters indicated significant difference at P<0.05 among the treatments with the same continuous cropping years yet different application rate of bio-organic fertilizer. Meanwhile， bars marked without the same uppercase letters indicated significant difference at P<0.05 among the treatments with different continuous cropping years yet the same application rate of bio-organic fertilizer.图1 不同处理对连作土壤黄瓜产量和品质的影响Fig.1 Effect of different treatments on cucumber yield and quality

从生物有机肥对连作土壤修复效果的角度分析，不同连作年限的土壤细菌、放线菌、木霉菌数量均随着施肥量的增加而增加，而尖孢镰刀菌的数量则随着施肥量的增加而下降，连作年限越长，减少的幅度越大，高用量下连作3、7、11 a的土壤尖孢镰刀菌数量分别比未施肥处理减少了75.13%、94.72%、97.37%。以上结果说明，生物有机肥能够有效抑制连作土壤中病害真菌的数量，改善土壤的微生态平衡，对长期连作土壤具有明显的改善效果。

2.3 对连作土壤酶活性的影响

土壤蔗糖酶、过氧化氢酶、脲酶、磷酸酶分别与碳循环、有机质转化、氮循环和磷循环相关，可以表示土壤的肥力质量。如图3所示，从连作年限的角度分析，随着设施黄瓜连作年限的增加，土壤蔗糖酶、过氧化氢酶、脲酶、磷酸酶活性总体呈现先提高后降低的趋势，在连作3 a时达到峰值，而后蔗糖酶和过氧化氢酶活性缓慢降低，脲酶和磷酸酶活性较大幅度地降低。从生物有机肥对连作土壤修复效果的角度分析，不同连作年限的土壤蔗糖酶、过氧化氢酶、脲酶、磷酸酶活性均随施肥量的增加而提高，且高用量生物有机肥对连作年限长的土壤酶活性的作用效果更明显。

2.4 不同处理下连作土壤质量评价

如图4所示，随着设施黄瓜连作年限的延长，土壤质量隶属度总体呈现了先升高后降低的趋势，在连作3 a时达到峰值，但连作年限越久，土壤质量越差。从生物有机肥对连作土壤修复效果的角度分析，不同连作年限的土壤隶属度均随施肥量的增加而提高，且生物有机肥对连作年限长的土壤质量的修复效果更好。

3 讨论

本研究表明，设施黄瓜土壤质量随着连作年限的延长呈现先升高后降低的趋势，连作3 a时最高，而连作11 a时最低，表现出了明显的连作障碍问题。土壤连作障碍发生的因素包括自毒物质和致病真菌的积累[18]。由于3 a的连作时间较短，土壤中还未积累过多的自毒物质和致病菌，加上人工管理对土壤质量的提升作用，因而连作3 a时土壤的质量最高，表现出高的黄瓜产量和品质。土壤细菌、放线菌和真菌的区系组成和数量变化常能反映出土壤生物活性水平[19]。在未施生物有机肥的处理中，随着连作年限的进一步延长，土壤细菌与真菌数量的比例不断减少，由未连作土壤的5 756∶1减少为连作11 a时的1 230∶1，土壤肥力由“细菌型”向“真菌型”转变，土壤中自毒物质和致病真菌不断积累，其中尖孢镰刀菌数量在连作7 a和11 a时分别比未连作土壤大幅提高了8.61倍和21.61倍，引发了严重的连作障碍问题，因而土壤生态质量和黄瓜产量品质都显著降低。马云华等[20]、贺丽娜等[21]、刘来等[22]研究了连作对温室黄瓜和大棚辣椒土壤性质的影响，结果均表明，土壤细菌和放线菌数量、土壤酶活性随连作年限延长先升高后降低，在连作5 a后开始降低，真菌数量和病原真菌数量一直增加，这与本研究的结果一致。

图2 不同处理对连作土壤微生物数量的影响Fig.2 Effect of different treatments on microbe number of continuous cropping soil

图3 不同处理对连作土壤酶活性的影响Fig.3 Effect of different treatments on enzymes activities of continuous cropping soil

图4 不同处理对连作土壤质量隶属度的影响Fig.4 Effect of different treatments on quality membership of continuous cropping soil

向连作土壤施入生物有机肥后，尤其是在高用量下，土壤质量能够恢复到或者超越未连作土壤水平。本研究施用的生物有机肥由木霉菌、北虫草废弃培养基和古龙酸母液混制堆肥而成。木霉菌是一种拮抗真菌，在识别病原真菌过程中能够分泌一系列细胞壁降解酶和次生代谢物，形成侵入结构，最终抑制病原真菌的增殖[8]。可能正是得益于此，本研究中施入高量生物有机肥处理的土壤病原真菌——尖孢镰刀菌的数量大幅度减少。同时，放线菌数量也随着生物有机肥施用量的增加而不断提高，高用量下连作土壤的放线菌数量高于未连作土壤，而放线菌大多能产生抗生素[23]，拮抗病原真菌。在上述因素的综合作用下，本试验施用的生物有机肥有效抑制了连作土壤中尖孢镰刀菌等病害真菌的发生。肥料中废弃北虫草培养基的主要成分为小麦粒，可为土壤微生物提供充足的有机物质。组成肥料的古龙酸母液含有丰富的低分子量有机酸，低分子量有机酸能够透过细菌较薄的细胞壁和细胞膜，作为能源物质被细菌利用[24]。这些因素都有利于促进土壤细菌的增殖。在连作11 a的土壤中，土壤细菌真菌比例由未施肥时的1 230∶1增加到高用量生物有机肥的1 473∶1，土壤肥力由“真菌型”向“细菌型”转变，土壤生态环境趋好。

土壤酶活性与土壤功能紧密相关，土壤生态系统改良通常都伴随着土壤酶活性的提高[25]。蔗糖酶、脲酶、磷酸酶活性分别与土壤碳、氮、磷循环密切相关，可以表征土壤中碳、氮、磷的转化能力，过氧化氢酶活性与有机质转化相关[26]，其活性被视作反映土壤肥力的指标[27]。生物有机肥中含有大量的有机质和氮、磷等养分，施入到连作土壤后作为酶的底物激发了相应土壤酶的活性。这也就意味着生物有机肥能够加速土壤养分元素的周转，提高土壤肥力。本研究中生物有机肥提高了连作土壤的微生物数量和酶活性，尤其是高用量生物有机肥使连作7 a和11 a土壤的微生物数量和土壤酶活性恢复到或超越未连作土壤水平，表明本试验所采用的生物有机肥能够有效改良连作土壤的生态质量，使其恢复到正常水平。一些学者将生物有机肥用于连作黄瓜[5]、连作番茄和辣椒[28]、马铃薯[29]、连作切花菊[30]土壤后，发现生物有机肥显著提高了连作土壤细菌、放线菌数量和土壤酶活性，降低了土壤真菌和病原真菌数量，这与本研究的结果基本一致。

生物有机肥施入设施黄瓜连作土壤后，土壤连作年限越长，生物有机肥修复土壤的效果越显著。这是因为该生物有机肥中的木霉菌是病原微生物的拮抗菌，对于连作年限短的土壤，病原菌含量很少，土壤质量较高，因而生物有机肥中只有废弃北虫草培养基和古龙酸母液可起到部分促进细菌增殖和提高土壤酶活性的作用。随着连作年限延长，土壤中的病原微生物急剧增多，生态质量变差，此时生物有机肥中的木霉菌能够充分发挥其抑制病原菌增殖的功能，同时与生物有机肥中的另外2种成分协同作用，因而展现出更明显的修复效果。