藜麦黄酒发酵工艺优化及抗氧化特性研究

张文刚 张 杰 党 斌 杨希娟

(1.青海大学农林科学院，青海 西宁 810016；2.青海省农林科学院青海省青藏高原农产品加工重点实验室，青海 西宁 810016；3.青海大学省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，青海 西宁 810016)

藜麦(ChenopodiumquinoaWilld)为藜科藜属一年生双子叶植物，原产于南美安第斯地区，由于其性质特征与小麦、水稻等常见谷物类似而被称为“假谷物”，它是目前联合国粮食及农业组织(FAO)认为唯一能满足人体基本营养需求的“全营养食品”[1]。藜麦蛋白质、氨基酸、维生素、矿物质等显著高于一般谷物，同时富含多酚、黄酮、皂苷、多糖等活性成分，表现出良好的抗氧化、抗肿瘤、降血脂、降血压、降血糖等功效，被国际营养学家称为“营养黄金”“未来食品”等[2-3]。目前，藜麦在中国山西、陕西、青海、四川、浙江等地区均有种植，作为一种“健康食品”原料具有广阔的开发前景[4]。

黄酒在中国酿造历史悠久，制作原料主要以稻米、黍米、小米、玉米等为主，其含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素，还含有多种有机酸、酯类物质及矿物质，兼具良好的食用和药用价值[5-7]，对避免当下精加工食品功能营养缺乏、防治慢性代谢疾病、改善肠道菌群、降低胆固醇等有积极意义[8]。传统黄酒酿造工艺周期长、原料利用率低、劳动投入大，近年来广泛使用的液化法酿造新工艺以微生物和酶制剂的液化、糖化和发酵为基础，具有适用性广、效率高、醪液流动性可控、易机械化等优点，在多种杂粮黄酒的酿制中已有应用[9-10]。刘浩等[11]以炒制燕麦为原料，利用液化法制作燕麦黄酒，优化工艺后可得到口味醇爽、品质符合国标的黄酒产品；杨祖滔等[12]研究显示，在最佳条件下薏米糯米黄酒香味清幽、口感醇和、色泽鲜亮。黄酒发酵过程中原料多酚和黄酮溶出，单宁转化为小分子酚类，蛋白质部分分解为活性多肽和氨基酸，这些物质是其发挥清除自由基、抑制肿瘤、调节细胞代谢、抗菌消炎等多种生理功效的重要物质基础[13-14]。藜麦具有“全营养”特征，具有发展不同类型功能黄酒的良好前景。目前，藜麦黄酒研究尚处初始阶段，对其加工技术及功能性分析还需深入探讨。

试验拟以藜麦为原料，采用液化法发酵藜麦黄酒，对液化、糖化及主发酵条件进行优化，在此基础上探讨发酵过程中酒体抗氧化特性，以期为藜麦黄酒等发酵产品的研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青藜2号：青海省农林科学院作物所；

耐高温α-淀粉酶(4.0×104U/g)、糖化酶(1.0×105U/g)：食品级，江苏瑞阳生物科技有限公司；

活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；

葡萄糖、福林酚、酪蛋白磷酸肽(Gly-Gly-Tyr-Arg)：分析纯，北京索莱宝科技有限公司；

3,5-二硝基水杨酸(DNS)、苯酚、过硫酸钾、硫片：分析纯，南京化学试剂有限公司；

甲醇、无水乙醇、氢氧化钠、酒石酸钾钠、亚硝酸钠、硝酸铝、碳酸钠、三氯乙酸(TCA)、硫酸铜：分析纯，天津市津北精细化工有限公司；

试验中使用的水均为去离子水。

1.2 仪器与设备

紫外分光光度计：N4S型，上海仪电分析仪器公司；

电子天平：AL204型，梅特勒—托利多仪器(上海)公司；

生化培养箱：LRH-150型，上海齐欣科学仪器公司；

高速中药粉碎机：FW200型，天津华鑫仪器厂；

电热鼓风干燥箱：101A-2ET型，上海试验仪器厂有限公司；

电热恒温水浴锅：DKB-600B型，上海一恒科学仪器有限公司；

离心机：Centrigue 5430R型，德国艾本德公司。

1.3 试验方法

1.3.1 藜麦预处理 藜麦除杂清洗后45 ℃烘干，磨粉过60目筛，取藜麦粉适量按一定料液比95 ℃糊化10 min。

1.3.2 还原糖含量测定 采用DNS法[12]。葡萄糖标准溶液(1 mg/mL)梯度为0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，2.0 mL，实际样品3 000 r/min离心后取上清液测定，根据标准曲线定量。

1.3.3 酒精含量测定 采用比重法[15]。

1.3.4 藜麦液化、糖化条件优化 以还原糖含量为指标，通过单因素和L9(33)正交试验优化藜麦液化、糖化条件。液化探讨因素包括液化时间(10，20，30，40，50，60 min)、耐高温α-淀粉酶添加量(3，4，5，6，8，10 U/g)、液化温度(80，85，90，95，100 ℃)；糖化探讨因素包括糖化时间(30，60，90，120，150，180，210，240 min)、加酶量(50，60，70，80，90，100，110 U/g)、糖化温度(40，45，50，55，60，65，70，75 ℃)。液化单因素试验固定条件：液化时间40 min、耐高温α-淀粉酶添加量5 U/g、液化温度95 ℃、料水比1.0∶3.5(g/mL)；糖化单因素试验固定条件：糖化时间90 min、糖化酶添加量80 U/g、糖化温度60 ℃。

1.3.5 藜麦黄酒主发酵条件优化 以酒精含量为指标，通过单因素和L9(33)正交试验优化藜麦黄酒主发酵条件。探讨因素包括料水比[1.0∶2.5，1.0∶3.0，1.0∶3.5，1.0∶4.0，1.0∶4.5，1.0∶5.0(g/mL)]、酵母接种量(3.0%，3.5%，4.0%，4.5%，5.0%)、发酵温度(24，26，28，30，32，34，36 ℃)。在优化参数下发酵藜麦黄酒，持续发酵8 d，连续监测总酚、总黄酮、多肽含量及抗氧化性。主发酵单因素试验固定条件：料水比1.0∶3.5(g/mL)、酵母接种量4.0%、发酵温度28 ℃。

1.3.6 总酚、总黄酮含量测定 参照Adom等[16]的方法，结果分别以没食子酸当量(μmol/100 g·DW)和Trolox当量(μmol/100 g·DW)表示。

1.3.7 多肽含量测定 参照康树杰等[17]的方法。酪蛋白磷酸肽浓度梯度为0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mg/mL(5% TCA)，样品以等体积10% TCA沉蛋白后，4 000 r/min离心15 min，取上清定容后，540 nm处测定OD值，按式(1)计算多肽的质量浓度。

C1=C0×50/2.5×100%，

(1)

式中：

C1——样品多肽的质量浓度，g/L；

C0——标准曲线中的多肽浓度，g/L。

1.3.8 抗氧化指标测定

(1)DPPH自由基清除能力：参照文献[18]。

(2)ABTS+自由基清除能力：参照文献[19]。

(3)FRAP铁还原力：参照文献[20]。

1.3.9 数据处理 采用Minitab 15软件及Excel进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 藜麦液化工艺优化

根据单因素试验结果选择适宜参数水平(见表1)，以还原糖含量为指标设计正交试验，试验结果见表2，方差分析见表3。

由表2、3可知，各因素对藜麦液化程度的影响主次顺序为高温α-淀粉酶添加量>液化温度>液化时间，最佳条件组合为A3B3C2，即液化时间50 min、酶添加量6 U/g、液化温度95 ℃；酶添加量和液化温度对液化物还原糖含量均有显著影响(P<0.05)，液化时间影响不显著；与刘浩等[11]研究结果基本一致。

表1 藜麦液化正交试验因素水平表

表2 藜麦液化正交试验结果

表3 藜麦液化正交试验方差分析表†

2.2 藜麦糖化工艺优化

根据单因素试验结果选择适宜参数水平(见表4)，以还原糖含量为指标设计正交试验，试验结果见表5，方差分析见表6。

表4 藜麦糖化正交试验因素水平表

表5 藜麦糖化正交试验结果

表6 藜麦糖化正交试验方差分析表†

由表5、6可知，各因素对藜麦糖化程度的影响主次顺序为糖化温度>糖化酶添加量>糖化时间，最佳条件组合为A3B3C2，即糖化温度70 ℃、糖化酶添加量100 U/g、糖化时间150 min，与刘浩等[11]研究结果一致；3个糖化影响因素对还原糖含量的影响均达到显著水平(P<0.05)。

2.3 藜麦主发酵工艺优化

根据单因素试验结果选择适宜参数水平(见表7)，以酒精度为指标进行正交试验，试验结果见表8，方差分析见表9。

由表8、9可知，各因素对醪液主发酵影响最大的为料水比，其次为酵母接种量，发酵温度影响相对较小；最优条件为A2B2C2，即料水比1∶4(g/mL)、酵母接种量4.0%、发酵温度30 ℃；料水比和酵母接种量对酒精度影响显著(P<0.05)。

2.4 发酵过程中黄酒活性成分及抗氧化活性的变化

2.4.1 总酚、总黄酮含量 由图1可知，总酚、总黄酮含量在整个发酵过程中均先增大后减小，在发酵6 d后又出现缓慢增加趋势。发酵前5 d，随着酵母繁殖和代谢作用的增强，发酵液酒精含量逐渐提高，使得总酚、总黄酮不断被浸提出[21]，同时在酵母作用下物料部分结合酚类被溶出，使得酚类化合物总量逐渐升高；发酵5～6 d时，酚类化合物明显降低，可能与单体酚聚合及酚类物质氧化等作用有关[22]；发酵6 d后，发酵体系中糖分减少使得发酵放缓，但随发酵时间的延长料液酒精度增加缓慢，部分结合酚释放及酚类继续溶出，使得酚类化合物含量再次增加。

表7 藜麦主发酵正交试验因素水平表

表8 藜麦主发酵正交试验结果

表9 藜麦主发酵正交试验方差分析表†

图1 藜麦糖化物发酵过程中总酚、总黄酮的变化

Figure 1 Changes in total polyphenol and total flavonoid contents during the fermentation of quinoa saccharide

2.4.2 多肽含量 由图2可知，随着发酵时间的延长，发酵液中多肽含量先升高后降低，发酵第4天，多肽含量达到最大值4.95 g/L；发酵7 d后多肽含量趋于稳定，保持在3.20 g/L左右。藜麦发酵过程中多肽主要来源于两个方面：① 微生物自溶；② 原料中的蛋白质分解。在发酵初期酵母大量繁殖并不断自溶，细胞中多肽释放进入发酵液中，同时蛋白质较多降解形成多肽；而在发酵后期微生物生长繁殖能力下降且蛋白质含量减少，多肽的形成与分解相对平衡，发酵液中多肽含量变化趋于稳定。

图2 藜麦糖化物发酵过程中多肽含量的变化

2.4.3 抗氧化性 由图3可知，DPPH自由基清除力、ABTS+自由基清除力及铁还原力在发酵过程中总体呈先增大后减小趋势。DPPH自由基清除能力在发酵第3天达最大值，之后快速降低，第4～8天变化缓慢；ABTS+自由基清除能力在发酵第4天达最高，第4～6天快速降低，而第6～8天出现波动；FRAP还原力在发酵初始(1～3 d)保持在较高水平，延长发酵时间，还原力逐渐下降，第8天保持在12.86 μmol/100 g·DW。藜麦发酵液中抗氧化性的变化可能与其活性物质含量和组成相关，总酚可能对FRAP铁还原力和DPPH自由基清除力影响较大，而总黄酮、多肽可能对ABTS+自由基清除能力影响较大。

图3 藜麦糖化物发酵过程中抗氧化活性的变化

3 结论

(1)藜麦黄酒的最佳液化、糖化及主发酵工艺条件为：耐高温α-淀粉酶添加量6 U/g，液化温度95 ℃，液化时间50 min；糖化酶添加量100 U/g、糖化温度70 ℃、糖化时间150 min；料水比1∶4(g/mL)、酵母添加量4.0%、发酵温度30 ℃。

(2)藜麦黄酒含有较多活性物质且随发酵时间呈动态变化，其中黄酒总酚、总黄酮在主发酵第5天达到峰值，后发酵阶段仍能保持较高水平；多肽含量发酵第4天达到4.95 g/L，发酵后期保持在3.20 g/L，发酵过程是酒体特征及活性物质形成的关键时期。

(3)藜麦黄酒清除DPPH、ABTS+自由基能力及FRAP铁还原力呈先升高后降低趋势，发酵第3天总体抗氧化性最强，发酵后期仍保持一定抗氧化活性；发酵液的体外抗氧化特征可能与其活性物质的形成及变化有关。

(4)试验中酵母添加量大，但发酵较缓慢，发酵物酒精度偏低，主要由于藜麦经液化糖化后还原糖含量低；后续可从醪液糖度调控、酵母选择等方面优化，并结合抗氧化性特征，制作品质、功能性较优的藜麦黄酒产品。