江西地区心脑血管患者CYP2C19基因多态性检测

余龙辉，周 洁，叶舒慧，呙 阳

心脑血管疾病是一种严重威胁人类健康的全球性疾病，尤其是影响50岁以上的中老年人健康的常见病，即使应用当下最先进、完善的治疗手段，仍可有50%以上的幸存患者生活不能完全自理。当前，氯吡格雷(clopidogrel)作为第二代噻吩吡啶类抗血小板药物，在心脑血管疾病的防治中运用广泛，主要作用于防止血栓形成方面。但研究[1-3]表明，氯吡格雷抗血栓作用并不能使所有患者受益，不同患者对氯吡格雷的反应有差异，同时部分患者反应性较低或无反应，称之为氯吡格雷低反应或氯吡格雷抵抗。然而其具体机制尚未明确，不过越来越多研究[4-5]显示基因多态性是氯吡格雷抵抗的一个重要原因。随着遗传药理学的发展，药物代谢酶基因中的某些位点的多态性可引起相应酶含量或酶活性的变化，从而影响药物代谢能力。而细胞色素P4502C19(cytochrome P450,family2,subfamily C, polypetide19,CYP2C19)酶作为细胞色素P450药物代谢酶家族中的重要一员，是氯吡格雷在体内生物代谢的关键酶，该研究旨在分析江西地区心脑血管患者CYP2C19基因型分布情况，以指导临床更合理地应用氯吡格雷，降低心脏再缺血、冠状动脉支架内血栓[6]和缺血性脑卒中[7]等不良心脑血管事件的风险，为实现个性化用药奠定遗传学基础。

1 材料与方法

1.1病例资料选取2016年1月～2018年1月因心脑血管疾病就诊于南昌大学第一附属医院3 408例患者，男2 183例， 22～94岁，中位年龄 67岁，女1 225例， 17～95岁，中位年龄70岁。抽取患者EDTA抗凝静脉血2～3 ml，当天提取DNA。

1.2仪器与试剂全自动基因提取仪购自苏州天隆公司，荧光定量PCR仪(ABI7500)购自美国应用生物系统公司，CYP2C19基因检测试剂盒购自苏州旷远生物分子技术有限公司。

1.3方法

1.3.1DNA提取 利用全自动基因提取仪进行提取所用标本DNA，具体步骤见说明书，并用定量分析仪检测其浓度和纯度合格后用于后续荧光定量PCR。

1.3.2荧光定量PCR法检测CYP2C19基因型 按照说明书指示，每份标本需添加四种反应液，即CYP2C192G、2A、3G及3A PCR反应液，同时加入内参探针对本次反应结果进行质量控制，并且每次实验均带上阳性对照和空白对照。PCR反应总体系：25 μl，其中上述四种反应液各23 μl，酶1 μl，模板1 μl。整个荧光定量PCR反应在ABI7500仪上进行。反应条件见说明书。程序结束，观察扩增曲线，分析Ct值数据，进行基因型结果判读。

1.3.3CYP2C19基因型检测 本实验共检测6种基因型：CYP2C19*1/*1、*1/*2、*1/*3、*2/*2、*2/*3和*3/*3型。3种代谢型判读方法为：*1/*1为快代谢型；*1/*2和*1/*3为中代谢型；*2/*2、*2/*3和*3/*3均为慢代谢型。

1.4统计学处理采用SPSS 19.0进行统计分析，计数资料采用百分数表示，组间比较用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1CYP2C19基因型分布采用“等位基因特异PCR”技术结合荧光探针检测CYP2C19基因，本研究3 408例患者中，结果显示CYP2C19基因型由多到少分布为*1/*2、*1/*1、*2/*2、*1/*3、*2/*3、*3/*3，所占比例分别为40.5%、40.1%、10.3%、5.9%、3.0%、0.3%。其男女基因型所占比例，差异无统计学意义(χ2=2.807，P=0.73)，见图1。

图1 CYP2C19基因型在不同性别中的分布[n(%)]

2.2CYP2C19等位基因在不同性别中的频率分布本研究3 408例患者中,CYP2C19*1、*2、*3的基因频率分别为63.3%、32.0%、4.7%，其在不同性别中的比例，差异无统计学意义(χ2=0.67，P=0.715)，见图2。

2.3氯吡格雷不同代谢型在不同性别中的分布本研究3 408例患者中，根据基因型判读，氯吡格雷代谢型主要以中代谢型(46.4%)为主，快代谢型和慢代谢型分别为40.1%和13.5%，其在不同性别中的比例，差异无统计学意义(χ2=0.471，P=0.79)，见图3。

2.4不同年龄段氯吡格雷代谢型于不同性别中的分布将3 408例患者分为6个年龄段，各年龄段各代谢型分别在男性和女性中所占比例比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

图2 CYP2C19等位基因在不同性别中的频率分布[n(%)]

图3 氯吡格雷代谢型在不同性别中的分布[n(%)]

表1 不同年龄段氯吡格雷代谢型在不同性别中的分布[n(%)]

3 讨论

随着人口老年化数量不断增加，我国心脑血管疾病患者基数也在不断增长，而氯吡格雷作为第二代噻吩吡啶类抗血小板药物，在心脑血管疾病的防治中效果显著，目前国内外临床研究[8]均提示经皮冠状动脉介入治疗术后可通过服用氯吡格雷以达抗血小板的功能，从而降低心血管事件发生率；同时，指南[9]指出氯吡格雷还可作为缺血性脑卒中及短暂性脑缺血发作二级预防的首选抗血小板药物。但是，氯吡格雷抗血小板作用普遍存在着个体差异，部分患者服用常规剂量氯吡格雷仍有较高的血小板活性，血栓事件的发生概率往往增加，以往认为这可能与药物间相互作用或患者依从性差等有关系，而氯吡格雷本身为无活性的一种前体药物，需在肝脏经过CYP2C19酶代谢生成活性产物，从而发挥抑制血小板的激活和聚集的作用[10]。而CYP2C19蛋白主要由CYP2C19基因介导，越来越多研究[10]表明CYP2C19基因多态性对CYP2C19酶活性起着重要作用。CYP2C19基因位于10号染色体10q24上，除了野生型等位基因CYP2C19*1，还存在多种单核苷酸多态性，而CYP2C19*2和CYP2C19*3为中国人最常见的等位基因，也称为功能缺失性等位基因。研究[11]显示其在氯吡格雷抵抗人群出现的频率大大高于非氯吡格雷抵抗人群，因此在实际临床应用中，可通过患者CYP2C19基因代谢型适当调整氯吡格雷剂量，以真正做到个体化医疗。

随着精准医疗的提出，越来越多热门遗传基因检测再次被人们所提及和关注，相关报道指出CYP2C19存在着广泛的地域、种族差异，探讨不同地区不同种族的CYP2C19基因多态性的分布特征将有助于指导临床用药。本研究的主要人群为南昌大学第一附属医院的心脑血管患者，共计3 408例患者，男2 183例，22～94岁，中位年龄67岁，女1 225例，17～95岁，中位年龄70岁，本研究采用“等位基因特异PCR”技术结合荧光探针的方法对3408例江西地区心脑血管患者进行CYP2C19基因多态性检测，结果显示CYP2C19*1、*2、*3的基因频率分别为63.3%、32.0%、4.7%，其CYP2C19*1型的携带率最高；而CYP2C19*1/*1、CYP2C19*1/*2、CYP2C19*1/*3、CYP2C19*2/*2、CYP2C19*2/*3、CYP2C19*3/*3基因型的频率分别为40.1%、40.5%、5.9%、10.3%、3.0%、0.3%，CYP2C19*1/*2型占江西地区的主导；其正常代谢型、中间代谢型、慢代谢型的频率分别为40.1%、46.4%、13.5%，以中间代谢型为主，与张爱玲 等[12]报道一致，仍有13.5%的患者为慢代谢型，其氯吡格雷低反应或氯吡格雷抵抗现象严重，应考虑调整剂量或换药；不同性别之间CYP2C19基因型及代谢型差异均无统计学意义(P>0.05)，各年龄段各代谢型差异也无统计学意义(P>0.05)这与相关文献[13-14]报道一致。本研究病例基数较大、年龄跨度大以及性别分布合理，能较好地体现江西地区CYP2C19基因多态性的分布特征。

心脑血管疾病作为我国疾病主要死因之一，为了更好地预防和治疗，氯吡格雷用药前的CYP2C19基因分型检测势在必行，本研究显示CYP2C19*1/*2型占江西地区的主导基因型，同时患者的年龄和性别与CYP2C19基因型分布并无直接影响，CYP2C19*1/*2作为中代谢型，据2013版临床药物基因组学实施联盟指南[15]指出CYP2C19*1/*2型急性冠脉综合征/经皮冠状动脉介入治疗患者常规剂量氯吡格雷可能效果不佳,可根据疗效适当小幅增加剂量,或换其他抗血小板药物，从而为患者制定个体化医疗方案，更大程度地降低不良事件的发生。