亚麻籽蛋白及其活性肽的研究进展

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(北京工商大学,北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,北京市食品添加剂工程技术研究中心,北京 100048)

亚麻(LinumusitatissimumL.)是属于亚麻科的一年生草本植物,起源于中亚或地中海地区,后来传播到中国和印度。古代栽培亚麻主要是为了获得纤维[1-2],后主要用途转变为对亚麻籽油的食用。亚麻籽油因其含有丰富的α-亚麻酸,能降低机体内低密度脂蛋白,而受到消费者的青睐[3-5]。全亚麻籽中包含了营养物(油、蛋白质、膳食纤维)、非营养物质(木脂素)和抗营养因子(粘胶、植酸、变应原、生氰糖苷、胰蛋白酶抑制剂、抗67-因子)等[6]。目前,全亚麻籽和亚麻籽油可直接供人类食用,提取油脂以后的亚麻籽饼粕被用作动物饲料、肥料或者废料处理,这造成了资源的极大浪费[7-9]。有学者发现,亚麻籽饼粕中蛋白质含量约在32%～49%之间[10],国内外的学者已经研究并报道了关于亚麻籽蛋白及其活性肽的不同功能特性,如抗氧化[11-14]、抗菌性[11]、抗炎性[13-14]、抗高血压[15-16]和降低胆固醇[17]等。本文详细阐述了亚麻籽蛋白的功能特性以及活性肽的生理活性,并对亚麻籽蛋白及其活性肽的提取制备方法进行了综述。

1 亚麻籽蛋白的研究进展

亚麻籽蛋白主要由球蛋白(11S、12S)和白蛋白(1.6S、2S)组成,球蛋白和白蛋白分别占总亚麻籽蛋白的56%～73.4%和20%～42%,其分子量分别约在252～298、10～50 kDa和10、16～17 kDa[11,18-19],其天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸含量较高。另外,Chung等[20]发现,亚麻籽蛋白具有比大豆分离蛋白或油菜籽蛋白更低的赖氨酸/精氨酸比率,其比率可低至0.25[21],这有利于开发婴幼儿食品或者作为改善心脏健康的营养补充剂[20-21]。亚麻籽蛋白具有与大豆分离蛋白相当的氨基酸模式,含有人体所必需的8种氨基酸,是一种优质的植物蛋白[3,16,22]。

1.1 亚麻籽蛋白的提取及纯化

油料蛋白的提取方法主要有对流提取法、逆流萃取、超滤工艺、等电点沉淀、离子交换、碱提酸沉法、反胶束溶液萃取、膜分离、酶法等方法[23]。基于蛋白含量、分子量以及电荷的不同,可以利用胶束化、碱提酸沉法或者等电点沉淀的方法,来分离不同的亚麻籽蛋白组分。

在亚麻籽蛋白提取分离方面,国内外普遍采用的方法是碱提酸沉法。国内学者的研究主要集中在亚麻籽蛋白提取工艺条件的优化方面。例如,许光映等[24]采用碱提酸沉的方法对分离亚麻籽蛋白的工艺条件进行研究,其研究结果表明,最佳工艺条件为:提取液pH9.5,料液比1∶30 (w/v),提取温度60 ℃,提取时间为180 min,在此条件下亚麻籽蛋白的提取率达到51.65%,提取的蛋白含量达到92.27%。虽然其蛋白含量可以达到分离蛋白的要求,但是提取率相对较低。胡爱军等[25]在碱提酸沉法的基础上,添加了超声波辅助,超声提取时间仅为非超声提取时间的1/3,经超声处理后提取率提高了35%。徐江波等[23]应用响应曲面法研究浸提温度、pH、时间、料液比对亚麻籽蛋白提取率的影响,并建立该工艺的二次项模型,在确定的最佳工艺条件下,亚麻籽蛋白提取率达到79.26%,纯度达到92.34%。目前,众多学者针对亚麻籽蛋白提取分离的工艺条件的探究已经比较全面,可以在此基础上进行中试研究,为工业化生产奠定基础。

国外对于亚麻籽蛋白的研究相对丰富。Oomah等[26]以及Pkjpd等[27]利用响应曲面法优化亚麻籽蛋白的提取工艺,与等电点沉淀相比,胶束化使蛋白质的回收率降低[28]。Krause等[29]在利用胶束化和等电点沉淀两种方法分离亚麻籽蛋白的基础上,进一步探究不同提取条件对亚麻籽蛋白分离物的组成、表面活性和流变学特性的影响。Tirgar等[30]研究了碱提酸沉法(A-FPC)、酶法(E-FPC)和酶溶剂萃取法(E-FPC)三种不同提取方法对亚麻籽蛋白功能特性的影响,发现A-FPC的表面疏水性以及乳化能力明显高于其他两种。Karaca等[31]的研究发现,盐析法提取的亚麻籽蛋白比等电点沉淀提取的亚麻籽蛋白具有更高的溶解度和表面活性,但其乳化能力低于乳清蛋白。Hassan等[32]利用凝胶过滤和离子交换层析对亚麻籽蛋白进行纯化,从而为探究其结构组成以及活性提供更好的基础条件。

1.2 亚麻籽蛋白的功能特性

蛋白质的功能特性是指食品体系在加工、贮藏、制备和消费期间影响蛋白质在食品体系中性能的物理和化学性质[33]。蛋白质的应用主要取决于蛋白质的功能特性。食品品质的高低在很大程度上取决于组合物的特性,与其他食物成分相比,蛋白质的功能特性是不可替代的。因此,了解并有效利用亚麻籽蛋白质的功能特性是必要的。

1.2.1 热变性 食品中蛋白质的功能特性通常是由蛋白质的结构决定的,加热可以改变蛋白质的结构,因此热处理可能会影响蛋白质的功能特性[34]。可以使用差示扫描量热法监测加热时蛋白质分子的结构变化以获得热转变温度,即变性温度[35]。Li-Chan等[18]利用差示扫描量热法对亚麻籽蛋白进行热分析,发现不同的亚麻籽蛋白组分的DSC曲线特征不同,其主要原因是由于蛋白质的提取及其纯化的方法步骤不同。对于通过阴离子交换色谱分离得到的亚麻籽蛋白(11S、12S),变性温度可达到114.7 ℃。而Kaushik等[21]提取分离的亚麻籽蛋白的变性温度是105 ℃;李高阳[36]利用双液相萃取技术提取分离的亚麻籽蛋白的变性温度是108 ℃。另外,与非蛋白质组分的相互作用也可能影响蛋白质的热性质。宋春芳等[37]同样利用差示扫描量热法研究亚麻籽粉蛋白质变性温度与亚麻籽含水率的关系,试验表明,亚麻籽粉中蛋白质变性温度随含水率变化呈抛物线状,当样品含水率为10%时,亚麻籽粉中蛋白质变性温度最高为140.86 ℃。与油菜籽蛋白(12S球蛋白变性温度为81 ℃、2S清蛋白的变性温度为60 ℃)相比,亚麻籽蛋白具有更好的热稳定性。

1.2.2 乳化能力 亚麻籽蛋白具有作为乳化剂的潜力[38]。酸性环境下有利于提高亚麻籽蛋白的乳化能力(84.76 mL/g)和乳化活性(88.37%)[39-40]。Kaushik等[21]将亚麻籽蛋白的乳化特性与酪蛋白酸钠、乳清蛋白、明胶以及大豆分离蛋白作比较,发现亚麻籽蛋白具有更高的乳化活性指数(375.51 m2/g)以及乳化稳定性指数(179.5 h);它们的平均乳液液滴大小顺序是:酪蛋白酸钠<亚麻籽蛋白<乳清蛋白<明胶<大豆分离蛋白。Tirgar等[30]发现,通过不同方法提取得到的亚麻籽蛋白的乳液在多分散性上与单模式液滴分布相似,在中性条件下带负电荷。

1.2.3 发泡性和保水性 发泡性主要是指蛋白在加工过程中其泡沫体积的增加率,而泡沫稳定性是指泡沫在一段时间内保持其体积稳定的能力[41]。亚麻籽蛋白的发泡性以及泡沫稳定性与蛋白浓度以及溶液的pH有关[42]。在亚麻籽蛋白浓度为0.1～0.8%,提高蛋白浓度能增强发泡性以及泡沫稳定性;在等电点附近,亚麻籽蛋白的发泡性最差但具有最强的泡沫稳定性[42]。研究从双液相萃取粕(TPS)和正己烷单相萃取粕(SP)提取的分离蛋白的发泡性,发现与大豆分离蛋白的发泡性(36.7%)和起泡稳定性(29.2%)、SP分离蛋白的发泡性(124%)和起泡稳定性(62.5%)相比,TPS分离蛋白的发泡性(139%)和泡沫稳定性(72.7%)更具有优势。因此,双液相技术也能明显改善亚麻籽蛋白发泡性以及泡沫稳定性[36]。 Kaushik等[21]发现亚麻籽蛋白的保水性与酪蛋白酸钠、乳清蛋白、明胶以及大豆分离蛋白等对照物类似。李高阳[36]的试验表明,双液相萃取技术能明显改善亚麻籽蛋白的保水性、保油性。

1.2.4 可溶性 对于可溶性蛋白质的表征,溶解度是影响蛋白质功能特性的因素之一。由于pH会影响蛋白结构的分子间相互作用,因此,亚麻籽蛋白的溶解度主要取决于pH[34]。有研究表明,pH对亚麻籽蛋白溶解度的影响呈典型的V形曲线[42]。在pH2～7的范围内,对蛋白质溶解度的影响相对较小;在pH7～11的范围内,对蛋白质溶解度的影响较大[42]。赵国华[42]等发现,盐浓度也能影响亚麻籽蛋白的溶解度,当NaCl浓度为0.4 mol/L时,亚麻籽蛋白具有明显的盐溶与盐析效应。

1.3 亚麻籽蛋白及其产品的开发应用

目前,亚麻籽饼粕的初加工产品已经应用于饮料、能量棒、面包以及火腿产品等[9]。亚麻籽蛋白与亚麻籽胶添加到低温肉制品烤肠与挤压火腿中,能与淀粉形成稳定的络合物,从而延缓淀粉的老化,同时其较好的亲水性和保水性,能有效解决产品水分流失问题,改善其组织结构,增强咀嚼性[43]。Hassan等[32]以及Xu等[44]利用微生物平板稀释法研究亚麻籽蛋白的抗微生物活性,结果表明,亚麻籽蛋白能抑制细菌活性,特别是对粪肠球菌、鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌的抑制效果明显。亚麻籽蛋白也能抑制真菌活性,例如青霉菌、禾谷镰刀菌和黄曲霉菌等。另外,值得关注的是,中性和碱性环境有利于亚麻籽蛋白抗真菌活性的稳定性[44]。在食品加工储藏过程中,由于亚麻籽蛋白的抗微生物活性效果明显,因此将其作为防腐剂添加到食品中具有广阔的前景。

2 亚麻籽活性肽的研究进展

肽是氨基酸以酰胺键相连而形成的化合物[45],一般分为寡肽(含有10个以下的氨基酸残基)和多肽(含有10～50个氨基酸残基)。由于肽在机体内具有一定的生理活性,例如抗氧化、降血压、降胆固醇、提高免疫力以及抗癌等活性,因此被称为活性肽[46-47]。活性肽一般是通过酶解动植物蛋白而得到的,可以添加到食品、药品等产品中[48],已被证明可作为营养补充剂,应用于人体以改善机体健康状况[49]。活性肽对人体健康的影响倍受重视,其在生物体内的提取及其在机体内的应用研究已成为学者们关注的焦点。

2.1 亚麻籽活性肽的制备及分离纯化

制备活性肽常用的方法是酶解法,其关键在于选择蛋白酶的种类和酶解条件的优化。常用的蛋白酶主要有碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶[12-13]。

亚麻籽蛋白酶解法制备活性肽的一般工艺流程[12,50-51]如图1所示。

图1 酶解法制备亚麻籽活性肽的工艺流程Fig.1 Process flow for preparation of flaxseed active peptide by enzymatic hydrolysis

另外,也有学者利用化学合成法来制备活性肽。化学合成法是目前使用最为广泛的肽合成法,分为液相合成法和固相合成法[52]。Silva[8]利用液相色谱-质谱/质谱联用技术(LC-MS/MS)以及Edman降解技术鉴定纯化后的亚麻籽活性肽组分,同时利用固相合成法合成序列为GFPGRLDHWCASE的亚麻籽活性肽。

分离纯化活性肽的方法有很多:膜分离技术、盐析法、电泳法以及层析技术等[53]。在分离纯化亚麻籽活性肽时,常采用的方法是超滤和凝胶过滤层析(尺寸排阻色谱法)。Hwang等[11]利用不同分子截留量的超滤膜分离亚麻籽蛋白酶解产物并测定其组分的抗氧化活性,低分子量活性肽比高分子量活性肽具有更好的抗氧化活性。

2.2 亚麻籽活性肽的生理活性

2.2.1 抗氧化活性 自由基参与许多生理和病理过程,是机体正常生长代谢的中间产物[54]。这些自由基可与体内的抗氧化酶以及其他抗氧化剂发生作用而被清除。因此,在正常状态下,机体内自由基维持在一定水平并处于动态平衡时,并不会对组织、细胞的功能造成损伤;但是,当机体内自由基过多而不能被清除时,自由基会与机体内的蛋白质、核酸等生物大分子发生氧化应激反应[55],生成大量的氧化物或者过氧化物,导致许多非传染性慢性疾病的发生,如动脉粥样硬化、糖尿病以及癌症等[54,56-57]。体内实验与自发性高血压大鼠膳食治疗相关的抗氧化防御水平已经表明,亚麻籽蛋白及其活性肽可用于改善机体内氧化应激状态[58]。

2.2.2 降胆固醇以及血糖活性 活性肽降胆固醇的主要依赖于末端氨基酸和疏水性氨基酸的比例。郑睿[17]探讨了亚麻籽蛋白酶解产物的降胆固醇活性,并利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS/MS)解析了四种具有降胆固醇活性的亚麻籽活性肽结构:RGGPGAPAPPR、QPPAMKNAPR、KGGLIAFAFVR和CLYLDVSATTR。通过分析其结构,可以得知N-末端上均为精氨酸;其次是疏水性氨基酸所占比例比较高。

活性肽降血糖的作用机理是促进细胞对葡萄糖的利用,加速糖原分解。Doyen等[63]通过电渗析分离亚麻籽蛋白酶解产物并分离两种特定的阳离子多肽组分(KCl-F1和KCl-F2),经过葡萄糖转运试验测试表明,组分KCl-F2能增加细胞中的葡萄糖摄取,从而达到降血糖的目的。

2.2.3 降低高血压活性 抑制机体内的血管紧张素转化酶(ACE)可以起到降血压的功效[64]。ACE能去除血管紧张素Ⅰ碳末端的组氨酸-亮氨酸,进而生成有血管收缩活性的血管紧张素Ⅱ,同时使舒缓激肽丧失活性,引发机体内血压的升高[51,64-65]。而食物蛋白中的活性肽已被证明可用作轻度或中度ACE和肾素活性的抑制肽[66]。

亚麻籽蛋白中富含丰富的精氨酸,其含量可高达11.2%,在血管内皮中存在时,可使血管舒张,从而达到降血压的目的[67-70]。Nwachukwu等[71]利用热解酶水解亚麻籽蛋白制备活性肽,并评估其组分在体外抑制血管紧张素I转化酶(ACE I)和肾素活性的效果;随后在自发性高血压大鼠中测试其最具活性组分的体内抗高血压效果,发现亚麻籽蛋白酶解产物能有效降低自发性高血压大鼠中的收缩压,也能有效抑制肾素活性[63,71-72]。Marambe等[15-16]的研究同样表明,亚麻籽蛋白酶解产物能够抑制ACE I的活性。利用碱性蛋白酶酶解亚麻籽蛋白释放的阳离子多肽可以抑制钙调蛋白依赖性磷酸二酯酶、ACE和肾素的活性,进而确定了亚麻籽蛋白的阳离子多肽的功能特性[73]。由于钙调蛋白、钙调蛋白依赖性磷酸二酯酶、ACE和肾素与人类慢性疾病的发病机理有关[74],过量会诱发高血压等心血管疾病,因此可以将亚麻籽蛋白阳离子多肽应用到治疗靶向性心血管疾病的多种症状中[63,73-74]。Udenigwe等[70,75]利用嗜热菌蛋白酶和链霉蛋白酶制备亚麻籽蛋白酶解产物,将其应用到肾素-血管紧张素系统中,同样发现亚麻籽蛋白酶解产物具有潜在的抗高血压的特性,并且发现该酶解产物中支链氨基酸与芳香族氨基酸的比例比较高为23∶1。同时Udenigwe[75]的研究证明,异亮氨酸-色氨酸是有效的肾素抑制剂二肽。抗高血压最有效的活性肽一般含有疏水性氨基酸或者带正电荷的氨基酸[76]。因此,亚麻籽蛋白及其酶解产物不仅可用于制备抗高血压功能性食品,也可以根据Fischer的比例特性,将其应用到治疗肝性脑病患者方面以及其他营养性食品[70]。

2.2.4 抑制微生物活性 抗微生物肽作用于多种病原微生物,如细菌、真菌和病毒[77]。抗菌肽是绝大多数机体内先天免疫系统的组成部分。它们可以通过与特定的靶细胞结合来调节DNA序列的复制、转录和翻译过程,从而阻止微生物细胞的繁殖和生长。另外,抗菌肽具有重要的免疫调节作用,这使得其能在宿主防御中发挥重要作用[77-78]。

Hwang等[11]测定了亚麻籽蛋白酶解产物的抗菌性,结果表明,分子量低于1 kDa的多肽组分具有更强的抗菌活性,特别是能够抑制铜绿假单胞菌以及大肠杆菌的生长。也有学者发现,从亚麻籽蛋白中分离出来的25 kDa的蛋白具有抗真菌的特性[21]。

2.2.5 免疫抑制作用 亚麻籽环肽是一种天然的疏水性环肽,存在于亚麻籽以及亚麻籽油中,具有免疫抑制活性[79-80]以及抑制破骨细胞分化[81]的特性。但根据目前可查询的文献发现,其研究主要集中在结构以及物理特性,还有基于少量的标本或体外分析的动物试验研究[68]。Górski等[82]发现,CYCLOLINOPEPTIDE(CLA)在小鼠体内具有免疫抑制活性,并且能够降低大鼠的胆固醇水平。Matsumoto等[80]利用二维核磁共振(2D NMR)光谱法和化学降解法解析了四种新的环亚甲基肽的结构,并确定了其对小鼠脾细胞具有免疫抑制活性。有研究表明,蛋白质～苯丙氨酸序列(肽)对抑制免疫活性降低抗体免疫反应具有重要意义[83]。

3 结论

目前的文献研究表明,动植物蛋白及其活性肽这一领域逐渐成为各种研究项目的主题。使用活性肽作为人类抗慢性疾病和维持身体健康的营养补充剂的趋势日益增长。酶解加工的活性肽经浓缩后,其生理活性更具有针对性以及特异性。多项研究证明,亚麻籽蛋白及其活性肽具有维持人体健康的多功能活性,从亚麻籽饼粕中制取纯度高、活性好、安全性强的活性肽具有潜在的商业价值。因此,未来的研究应侧重于亚麻籽蛋白及其活性肽的体内研究:关注生物利用率、探究分子间相互作用机制等。分子水平和基因工程基础上的亚麻籽蛋白及其活性肽产品有待于开发,这可以作为亚麻籽产品开发利用的切入点,从而使亚麻籽蛋白及其活性肽在保健食品和治疗药物等方面为人类做出更大的贡献。