甘草超滤液中甘草酸的络合萃取研究

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(甘肃中医药大学药学院,甘肃兰州 730000)

甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)作为药食兼用品种,其性味甘平,归心、肺、脾、胃经,具有补脾益气、祛痰止咳、清热解毒、缓急止痛、调和诸药等功效[1]。甘草酸是甘草中的主要有效成分之一[2]。现代研究证实甘草酸具有抗炎、抗过敏、抗氧化、免疫调节、抗病毒、抗癌、保肝等多种作用[3]。此外甘草酸还是天然甜味剂,其甜度为蔗糖的200～300倍,可广泛用于食品、医药、化妆品、卷烟等行业,应用非常广泛[4-5]。

目前通常采用水浸提,经酸沉得甘草酸粗品,再用重结晶、大孔树脂吸附等方法纯化甘草酸的生产工艺[6]。该工艺周期长、纯化过程复杂,成本高,而且甘草酸得率低,浪费药材资源。针对上述问题,本文将超滤作为前置技术,处理甘草水提取液,再采用络合萃取技术萃取分离甘草超滤液中的甘草酸。

络合萃取技术分离极性有机物稀溶液的实施关键为络合萃取体系的选定,主要包括络合剂、稀释剂选择及混合络合萃取剂组成研究等内容。本文以前期课题组在研究甘草水提取液超滤工艺的基础上[7],拟通过改变混合络合萃取剂组成(络合剂、稀释剂种类)及各组分的体积分数,研究萃取剂组成对甘草超滤液中甘草酸络合萃取效果的影响,为采用超滤-络合萃取技术制备较高纯度甘草酸提供一种新的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甘草药材 兰州市黄河药材市场;甘草酸铵对照品(批号110731-201619)、甘草苷对照品(批号111610-201607) 中国食品药品检定研究院;磷酸三丁酯(TBP) 烟台市双双化工有限公司;三烷基氧化磷(TRPO) 溧阳市凯信化工有限公司;磺化煤油 广东正茂石化有限公司;石油醚 天津市进丰化工有限公司；乙腈 国产色谱纯;其他试剂 均为国产分析纯。

Agilent-1100高效液相色谱仪 美国安捷伦公司;ABT100-5M电子天平 德国KERN公司;MX-RL-Pro LCD数控旋转混匀仪 大龙兴创实验仪器北京有限公司;DD-5M 湘仪离心机 湘仪离心机仪器有限公司;DK-98-ⅡA电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司;SJM陶瓷超滤设备超滤膜(50 nm) 合肥世杰膜工程有限公司;BDS HYPERSIL-C18色谱柱(250×4.6 mm,5 μm) 赛默飞世尔科技(中国)有限公司;AKRY-UP-1816型超纯水机 成都唐氏康宁科技发展有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 甘草的提取 称取一定量甘草药材(已切片,厚度2～4 mm),采用普通加热回流提取法,每次用药材质量8倍量的0.75%(V/V)的氨水提取1 h,重复提取3次,合并提取液。放置过夜(12 h)后取上清液,剩余药液经3 000 r/min常温离心15 min,收集上清液,合并上清液,在孔径50 nm、压力0.12 MPa、温度25 ℃的条件下用无机陶瓷膜超滤,得甘草超滤液,置搪瓷方盘水浴(94 ℃)浓缩至甘草生药量为0.2 g/mL,冷却至室温,备用[7]。

1.2.2 甘草超滤液中甘草酸及甘草苷的萃取 取10 mL 1.2.1中得到的甘草超滤液于50 mL离心管中,再加入10 mL按比例配好的络合萃取剂,将离心管固定在旋转混匀仪上常温萃取12 h(25 r/min),取出,常温离心10 min(4000 r/min),取1 mL下层萃余液于50 mL容量瓶中,用70%乙醇定容。

1.2.3 单因素实验设计

1.2.3.1 不同稀释剂对甘草酸萃取效果的影响 根据稀释剂的物理、化学特性,本文选择惰性溶剂磺化煤油、非极性溶剂石油醚作为稀释剂。以甘草酸的萃取率和甘草酸与甘草苷的分离率为指标,分别以TRPO和TBP为络合剂,与各稀释剂构成二元混合萃取剂对甘草超滤液进行萃取。在一定浓度范围内,络合剂浓度越高越有利于生成络合物,但超过该浓度范围会形成中间相[6,9]。为避免中间相的产生,结合文献和甘草超滤液自身特性,先将络合剂与稀释剂按10%(V/V)络合剂+90%(V/V)稀释剂的比例混合,按1.2.2中方法制备样品并进行测定分离率及萃取率,考察稀释剂种类对萃取效果的影响。

1.2.3.2 不同络合剂对甘草酸萃取效果的影响 在上述实验的基础上,选择磺化煤油为稀释剂,分别与不同浓度(10%、20%、30%、40%、50%、60%,V/V)的TBP和不同浓度(5%、10%、15%,V/V)的TRPO构成二元混合萃取剂,对甘草超滤液进行萃取。按1.2.2中方法制备样品并进行测定,考察络合剂种类和浓度对甘草酸萃取效果的影响。

1.2.4 三元络合萃取剂对甘草酸萃取率的影响 为了进一步提高甘草酸的萃取率,将TRPO+TBP+磺化煤油构建为三元络合萃取剂,以甘草酸的萃取率为指标,通过析因实验考察TBP、TRPO在络合萃取甘草酸时是否具有协同作用。将TBP和TRPO的浓度确定为析因实验的两个因素,每个因素取3个水平进行实验,以期优选出最佳的混合萃取剂。实验因素、水平设计见表1。

表1 析因实验因素水平表Table 1 Factors and levels of factorial experiment

1.2.5 甘草酸和甘草苷的含量测定

1.2.5.1 对照品溶液的制备 分别取甘草酸铵和甘草苷对照品适量,精密称量,加70%乙醇制成含甘草酸铵0.216 μg/μL、甘草苷0.0225 μg/μL的混合对照品溶液,备用[8]。

1.2.5.2 甘草超滤液供试品溶液的制备 精密量取1.2.1中得到的甘草超滤液1 mL于50 mL容量瓶中,加70%乙醇定容,摇匀,备用。

1.2.5.3 色谱条件 色谱柱为BDS HYPERSIL-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);进样量10 μL;以乙腈为流动相A,以0.05%(V/V)磷酸溶液为流动相B,按表2中的规定进行梯度洗脱;流速1 mL/min;柱温26 ℃;测定波长237 nm[8]。

表2 梯度洗脱表Table 2 The table of gradient elution

1.2.5.4 标准曲线测定 分别精密吸取1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μL混合对照品溶液,注入高效液相色谱仪测定,以峰面积为纵坐标(Y),进样量为横坐标(X)作回归曲线,得甘草酸回归方程:Y=140.5X-24.746,R2=0.9999,线性范围0.216～4.320 μg;甘草苷回归方程:Y=35.121X+18.267,R2=1,线性范围0.0225～0.45 μg。

1.2.5.5 甘草超滤液样品定量测定 将1.2.5.2中方法制备的甘草超滤液样品按1.2.5.3中条件进行测定,并按回归方程计算甘草酸和甘草苷量。

1.2.6 萃取率与分离率的计算

萃取率(%)=100-[萃余液中甘草酸量(甘草苷量)/甘草超滤液中甘草酸量(甘草苷量)]×100

分离率(%)=|甘草酸萃取率(%)-甘草苷萃取率(%)|

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 不同稀释剂对甘草酸萃取效果的影响 由表3和表4可知,以磺化煤油为稀释剂时,络合剂TRPO、TBP对甘草酸的萃取率均高于以石油醚为稀释剂时的萃取率,同时以磺化煤油为稀释剂时，甘草苷与甘草酸的分离率也高于石油醚。因此选择磺化煤油作为稀释剂。

表3 不同稀释剂对TRPO萃取甘草酸的影响Table 3 Effects of different diluents on the extraction of glycyrrhizic acid by TRPO

表4 不同稀释剂对TBP萃取甘草酸的影响Table 4 Effects of different diluents on the extraction of glycyrrhizic acid by TBP

2.1.2 不同络合剂对甘草酸萃取效果的影响 由表5可知,10%～50%(V/V)浓度范围内随着TBP浓度增加,甘草酸的萃取率呈上升趋势,但60% TBP对甘草酸的萃取率低于50% TBP。这可能是由于TBP浓度增大时,萃取相粘度随之增大,当TBP 浓度达到60%左右时,开始出现乳化现象所致,故选择60% TBP作为下一步析因实验第一个因素的最大水平。由表6可知,5% TRPO对甘草酸的萃取率最高,但在5%～15% TRPO范围内,随着体系中TRPO的浓度增大,甘草酸的萃取率逐渐降低,因此后续实验TRPO的浓度梯度为3%、6%、9%。另外,在表5中,50% TBP+50%磺化煤油对甘草酸的萃取率最高,为30.73%,但甘草苷与甘草酸的分离率仅为10.43%;而在表6中,15% TRPO+85%磺化煤油对甘草苷的萃取率高达99.59%,但对甘草酸的萃取率仅有8.28%。实验结果表明TBP与TRPO各有优势,TBP更适用于萃取甘草酸,而TRPO更适用于萃取甘草苷,若既要络合萃取出超滤液中的甘草酸,又要实现与甘草苷的分离,则需二者配合使用,因此TBP和TRPO均有作为络合剂的可能。

表5 TBP浓度对甘草酸萃取及分离效果的影响Table 5 Effects of TBP concentration on extraction and separation of glycyrrhizic acid

表6 TRPO浓度对甘草酸萃取及分离效果的影响Table 6 Effects of TRPO concentration on extraction and separation of glycyrrhizic acid

2.2 三元络合萃取剂对甘草酸萃取率的影响

由表7可知,对超滤液中甘草酸的萃取率最高的萃取剂组合为2/2组,即6% TRPO+50% TBP+44%磺化煤油,最高萃取率为32.98%±0.04%,高于两元络合萃取剂。由表8分析结果可看出,TRPO浓度、TBP浓度、以及TRPO与TBP的交互作用都对甘草酸的萃取率有极显著影响(p<0.01)。

表8 实验结果的方差分析表Table 8 Variance analysis table of experimental results

表7 不同萃取剂组合对甘草酸萃取率的影响(n=3)Table 7 Effects of different extractant combinations on extraction yield of glycyrrhizic acid(n=3)

因此,本文拟用两步萃取法制备甘草酸,即先用对甘草苷的单次萃取率和甘草酸与甘草苷的分离率均最高的15% TRPO+85%磺化煤油作为萃取相,萃取甘草超滤液中的甘草苷,将甘草酸尽可能多的留在水相中,再用三元混合萃取剂6% TRPO+50% TBP+44%磺化煤油萃取已经移取甘草苷的萃余水液,得到纯度较高的甘草酸。

3 讨论

3.1 在甘草酸的络合萃取中超滤甘草提取液的必要性

甘草水提取液中含有大量水溶性淀粉、蛋白质、果胶等大分子杂质,这些水溶性大分子的存在会显著增大料液粘度,而粘度是油水乳化的主要影响因素之一,萃取过程中油水乳化程度随粘度的增大而增加[10]。同时由于甘草酸有微弱的表面活性作用,因此在对甘草水提取液的萃取过程中乳化现象非常严重。乳化现象是将萃取技术用于甘草水提取液中甘草酸分离时必须解决的问题。

本文将超滤作为络合萃取的前处理技术,在络合萃取前将甘草水提取液进行超滤处理,在目标成分得到有效保留的情况下,可以除去其中的大量水溶性大分子杂质,使料液粘度显著降低,乳化现象大为改善,使甘草酸的络合萃取过程可以顺利进行,络合萃取剂的使用浓度显著提高[6],有效提高了络合萃取效率。

3.2 络合萃取法萃取分离甘草酸的优势

甘草酸是一种在水中溶解性较好的极性较大有机物,要将它和甘草水提取液中极性接近的黄酮类物质分开,如采用传统的物理萃取需要采用极性较大的有机溶剂,不但有机溶剂在水中的溶解损失较大,而且很难达到精确分离。

络合萃取是一种化学萃取的方法,其基本原理是根据待分离溶质的Lewis酸碱性质,选择合适的络合萃取剂与极性较大有机物形成络合物,并在有机相中得到富集,络合萃取过程中的化学反应有较高的选择性[11]。富集于有机相的络合物可在反萃取过程中分解重新得到极性较大有机物,达到分离纯化的目的。在萃取过程中水相中为极性有机物,有机相中为该有机物的络合物,为两种不同物质。萃取过程的推动力是待分离成分和络合剂间的化学键能,因此即使料液中待分离成分浓度很低,络合萃取的分配系数也会很大[12]。该技术对于分离极性较大的有机物稀溶液具有很高的应用价值。采用络合萃取不但有利于甘草酸和黄酮类物质的高效分离,而且通过反萃取可实现络合萃取剂的循环使用,有效解决物理萃取方法萃取剂损失大、产品溶剂残留、工艺成本高等技术缺陷。

3.3 稀释剂的选择

稀释剂是络合萃取剂的主要组成成分,具有调节混合萃取剂粘度、密度及界面张力等参数,降低混合萃取剂萃水量的作用,因此稀释剂的选择是研究络合萃取工艺的主要内容[13]。本文分别以磺化煤油和石油醚为稀释剂,考察了不同类型稀释剂对甘草超滤液中甘草酸萃取效果的影响,发现以磺化煤油为稀释剂时,对甘草酸的萃取率以及甘草苷与甘草酸的分离率均高于石油醚。

络合萃取效率与混合萃取剂对萃合物的溶解能力正相关[13]。本文研究表明以磺化煤油为稀释剂对甘草酸有较好的萃取效率,说明磺化煤油不但可以有效降低络合萃取剂的粘度,减小传质阻力,而且对甘草酸萃合物有很好的溶解能力。此外磺化煤油在水中不溶,以其为稀释剂组成的混合络合萃取剂的水溶性小,萃取过程中溶剂流失少,通过萃取剂再生循环使用可有效降低生产成本。

3.4 三元络合萃取剂的协同效应

在以TBP为络合萃取剂，磺化煤油为稀释剂时,在TBP的使用浓度50%时甘草酸的萃取率30.73%。由析因设计得到的6% TRPO+50% TBP+44%磺化煤油对甘草酸的单次萃取率为32.98%±0.04%。显示三元络合萃取剂对甘草酸的萃取有协同作用,可在一定程度上提高萃取效率。

4 结论

选用的两种络合萃取剂对甘草酸和甘草苷均有一定的络合萃取作用,为制备纯度较高的甘草酸,拟用两步萃取法,由于15% TRPO+85%磺化煤油的混合萃取液对甘草超滤液中甘草苷的单次萃取率为99.59%,甘草酸与甘草苷的分离率为91.31%;故可先用该混合萃取剂萃取甘草超滤液中的甘草苷,将甘草酸留在水相中。再用实验优化出的三元混合萃取剂6% TRPO+50% TBP+44%磺化煤油萃取已经移取甘草苷的萃余水液,得到纯度较高的甘草酸。该两步络合萃取法既能得到甘草酸,同时还可收集到副产品甘草苷。