日粮添加BHT对饲喂氧化豆油黄羽肉鸡肌肉品质和抗氧化能力的影响

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(南京农业大学动物科技学院,江苏南京 210095)

豆油不仅能为肉鸡提供充足的能量,还能为其提供所需的必需脂肪酸。豆油富含多不饱和脂肪酸,因此极易被家禽消化吸收。但实际生产中,往往会因为油料储存不当导致油脂氧化,而富含多不饱和脂肪酸的油脂更容易被氧化[1]。在氧化油脂研究中,通常用过氧化值和酸价,丙二醛(MDA)含量三个指标,来检测一级产物和二级产物的含量,并且以此评价油脂的氧化酸败程度。其中MDA是氧化酸败最重要的有毒有害二级产物之一。它能与蛋白质产生交联作用,改变细胞生理功能,造成细胞损伤[2]。姚仕彬等[3]对草鱼肠道黏膜细胞培养试验发现,1.23～9.89 μmol/L MDA能够显著损伤草鱼肠道黏膜细胞。林秀秀等[4]研究发现,饲喂大于124 mg/kg MDA会引起草鱼肝脏的抗氧化应激。岳洪源[5]研究发现蛋鸡在饲养期摄入高度氧化豆油(MDA=342.2 nmol/mL),其鸡蛋品质和机体抗氧化状况均会受到显著影响。国内外研究发现,在家禽日粮中添加氧化豆油,会导致家禽生产性能下降[2]、肌肉抗氧化性能降低,肉品质变差[6]、货架期缩短以及不良风味形成,从而损害消费者的健康及利益。研究发现,在日粮中添加抗氧化剂,能够有效降低甚至消除肉鸡肌肉对活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的敏感性[7-8]。

2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(butylated hydroxytoluene,BHT)是一种极其稳定的人工合成多酚类抗氧化剂。自20世纪50年代以来,BHT因具有稳定食品新鲜程度、营养价值、口味及颜色,防止或者延缓含油食品、肉品的脂质氧化[9]等特点,而被广泛应用于食品行业。国内外学者在对BHT的体外研究中发现,BHT能够稳定高效地清除多种自由基[10],Freitas等[11]试验发现,给Rose308肉鸡饲喂含0.02% BHT的日粮42 d,能够显著降低胸肌肌肉中硫代巴比妥酸反应物(thiobarbituric acid reactive substances,TBARS),延长货架期[8]。Ighodaro等[12]研究CCl4诱导的Wistar大鼠软组织氧化损伤模型时,发现试验大鼠口服100 mg/kg大鼠体重的BHT 7 d,能够显著提高机体的抗氧化能力。Lu等[6]研究发现,在含有氧化油脂日粮中添加100 mg/kg混合人工合成抗氧化剂能够显著缓解氧化损伤。关于BHT在优质黄羽肉鸡中的应用,以及在氧化豆油影响下,日粮中添加BHT对黄羽肉鸡肉品质,肌肉抗氧化性能的影响,国内外鲜有报道。因此,本试验以优质黄羽肉鸡为研究对象,研究氧化豆油影响下,日粮中添加125 mg/kg BHT对黄羽肉鸡肉品质以及抗氧化性能的影响并测定相关基因转录水平以探究其抗氧化机理。为BHT在黄羽肉鸡肉品质以及对肌肉抗氧化方面的研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

饲料级BHT 由江苏迈达新材料股份有限公司提供,纯度高于99.9%;黄羽肉鸡 240只1日龄,安徽和威农牧有限公司;豆油 江苏盐城当地作坊;日粮预混料原料 浙江新维普添加剂有限公司;MDA试剂盒、还原性谷胱甘肽(glutathione,GSH)试剂盒、总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)试剂盒、过氧化氢酶(catalase,CAT)试剂盒、总抗氧化能力(total antioxidative capacity,T-AOC)试剂盒 南京建成生物工程研究所;RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、定量试剂盒 日本TaKaRa生物技术股份有限公司。

I9025型pH计 意大利Hanna Instruments公司;CR-400型色度计 日本柯尼卡美能达集团;HH-4数显电子恒温循环水浴锅 常州国华电器有限公司;C-LM3B数显式肌肉嫩度仪 北京维欣仪奥科技发展有限公司;ACS(系列)电子秤 永康市永州衡器有限公司;Model PRO 200 double insulated匀浆机 美国ProScience公司;BIO-RAD680酶标仪 美国Bio-Rad公司;ND 2000微量紫外分光光度计 美国Thermo Fisher Scientific公司;QuantStudio®5 Real-Time PCR仪 美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 试验方法

1.2.1 氧化豆油的制备 新鲜压榨豆油,氧化豆油制备方法参照Ehr等[13]的方法,并加以修改,试验所需1/5油脂在180 ℃下快速高温氧化6 h,转入烘箱与试验所需剩余油脂充分混合,并在(95±1) ℃条件下加热14 d。烘箱(95±1) ℃氧化阶段,利用增氧设施每隔15 min通入氧气,增氧设备由自动计时开关控制,通氧速率为4 L/min,氧化结束时与新鲜豆油5∶1(氧化∶新鲜,v/v)混合,即完成制备,所得豆油为试验用氧化豆油。试验用氧化豆油与试验用新鲜豆油均储存在(10±5) ℃环境中。饲用前一天测定试验用豆油的过氧化值(方法参见GB 5009.227-2016)、酸价(方法参见GB 5009.229-2016)、MDA含量测定(采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定)。试验用新鲜豆油:过氧化值POV(2.4 mmol/kg)、酸价(0.8 mg KOH/g)、丙二醛MDA含量(13.4 nmol/mL)。试验用氧化豆油:过氧化值POV(17.4 mmol/kg)、酸价(6.2 mg KOH/g)、丙二醛MDA含量(376.7 nmol/mL)。

1.2.2 饲料的准备 本试验选用玉米-豆粕型基础日粮,参考NRC《家禽营养需要》(1994)标准完成饲料配方设计。配方原料组成以及营养组成详见表1。

表1 试验日粮配方及其营养水平Table 1 Composition and nutrient levels of the experimental diets

1.2.3 试验设计与饲养管理 本试验采用2×2因子设计,即豆油类型和日粮中BHT的添加浓度。豆油类型根据其品质不同分为新鲜豆油和氧化豆油两种;结合本实验室前期预实验结果,选取日粮中BHT的添加浓度分别为0、125 mg/kg。试验选用240只1日龄体重接近,健康的黄羽肉鸡,随机分为4组,每组6重复,每个重复10只鸡,饲喂四种日粮58 d。试验采用日粮均为混合粉料,严格按照配方配制,机械充分混合后分装待用。分成以下几组：新鲜豆油组(F-CON组),饲喂不含BHT的新鲜豆油日粮;新鲜豆油BHT组(F-BHT组),添加125 mg/kg BHT的新鲜豆油日粮;氧化豆油组(O-CON组),饲喂不含BHT的氧化豆油日粮;氧化豆油BHT组(O-BHT组),添加125 mg/kg BHT氧化豆油日粮。本试验采用立体笼养,自由采食,饮水,保持24 h光照,常规免疫。

1.2.4 样品采集与处理 试验第57 d停饲12 h,饮水正常,于第58 d每个重复选取1只接近平均体重的黄羽肉鸡,4个处理共选取24只鸡,鸡颈部静脉放血宰杀,迅速取出胸肌及腿肌,采胸肌腿肌样各3 g装于冻存管中,立即置于-80 ℃用于之后的酶活及转录水平的测定。剩余肌肉采取左侧胸肌及腿肌于自封袋中并迅速放置在4 ℃冰箱中,用于pH及肉色的测定;右侧胸肌及腿肌放入提前标注好的自封袋中,迅速放入-20 ℃冰箱存储,用于滴水损失、蒸煮损失及剪切力的测定。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 肉色测定 参考Zhang等[14]的试验方法,宰后24 h立即将剥离的肌肉平放在白色瓷砖上,选靠近骨侧肌肉长轴中线,由厚到薄取三点位置,利用色差仪测定并记录胸肌及腿肌的亮度值(L*)、红度值(a*)、黄度值(b*)。

1.3.2 pH测定 参考席鹏彬等[15]的测定方法,沿肌肉长轴方向,选取三点,十字刀口,将pH计探针插入开口处0.5～1 cm处,利用pH计测定宰后45 min胸肌及腿肌的pH,于宰后24 h再次测定并记录样品pH。

1.3.3 滴水损失 参考Zhang等[16]测定方法并稍作改动,取出胸肌腿肌肉样,切成3 cm×3 cm×1 cm的条形肉样,称初始重,悬挂在保鲜膜包裹的网篮中(保证样品不与篮壁接触),放入4 ℃冰箱内存放分别于24和48 h取出再次称重，滴水损失率计算见式(1)、式(2)。

24 h滴水损失率(%)=[初始重(g)-24 h肉样重(g)]/初始重(g)×100

式(1)

48 h滴水损失率(%)=[初始重(g)-48 h肉样重(g)]/初始重(g)×100

式(2)

1.3.4 蒸煮损失 参考Zhang等[16]测定方法,取出存放在4 ℃ 24 h的胸肌腿肌样品,取15 g左右样品,放入自封袋中密闭,并置于75 ℃水浴锅中,加热至中心温度达70 ℃,取出冷却,擦干水分再次称重，蒸煮损失率计算见式(3)。

蒸煮损失(%)=[蒸煮前肉样重(g)-蒸煮后肉样重(g)]/蒸煮前肉样重(g)×100

式(3)

1.3.5 剪切力 参考Gao等[17]的方法进行测定,将蒸煮后的肉样沿纤维方向修整成1 cm×1 cm×3 cm的长条块状,利用肌肉嫩度仪垂直于肉纤维方向进行切割,读数并记录每个肉样的剪切力,单位为N,每个肉样剪切3次测定平均值。

1.3.6 抗氧化指标测定 取胸肌和腿肌样品约0.25 g,按照1∶4 (m/v)加入生理盐水,在冰水浴条件下利用匀浆机匀浆,匀浆液在4000 r/min条件下离心10 min,取上清液,迅速保存在-20 ℃。主要测定肌肉中MDA和GSH含量,测定肌肉组织中T-SOD活力、GSH-Px活力、CAT活力,以及肌肉的T-AOC。

1.3.7 肌肉组织抗氧化相关基因转录水平测定 采用实时定量PCR法测定抗氧化相关基因转录相关因子2(NF-E2-relatedfactor2,Nrf2)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶调节亚单位(γ-modifier subunit of glutamate-cysteine ligase,γ-GCLm)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(γ-catalytic subunit of glutamate-cysteine ligase,γ-GCLc)、谷胱甘肽过氧化物酶1(superoxide dismutase 1,SOD1)以及过氧化氢酶(catalase,CAT)在肌肉组织中的表达量。

采用试剂盒提取肌肉中总RNA,利用微量分光光度计,初步检测提取RNA的浓度及纯度的。利用用逆转录试剂盒反转RNA,并将反转后的cDNA存放在-20 ℃待用。按照TaKaRa公司SYBR Primix Ex Taq TM试剂盒说明书,采用10 μL体系进行qRT-PCR实验：cDNA 2 μL、SYBR Premix Ex Taq 5μL、上游引物0.2 μL、下游引物0.2 μL、ROX Reference Dye 0.2 μL、超纯水2.4 μL。通过NCBI查找基因序列,利用Primer 3 plus等软件进行特异性引物的设计,生物公司合成引物。PCR反应程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s(重复40循环);95 ℃ 15 s;60 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s。以β-actin作为内参基因,利用2-ΔΔCt法对目的基因mRNA表达进行定义与计算,目的基因引物序列见表2。

表2 qRT-PCR引物序列Table 2 Sequences of real-time PCR primers

1.4 数据统计及分析

采用SPSS 22.0中一般线性模型(general liner model,GLM)对实验数据进行主效应(油脂和BHT水平)及互作效应的差异显著性检验。p值小于0.05时认为差异显著,当互作效应p值小于0.05时,各处理组采用Turkey法进行多重比较。统计结果以平均值±标准差形式表示。

2 结果与分析

2.1 氧化豆油与BHT对黄羽肉鸡肌肉品质的影响

肌肉的pH、肉色、滴水损失、蒸煮损失以及嫩度是常用来评价肉品质的指标。肉色能够直接影响消费者对产品的选择。滴水损失和蒸煮损失均能一定程度上影响肉的多汁性、嫩度、色泽以及营养成分的流失。表3、表4数据显示,与新鲜豆油组相比,氧化豆油组胸肌、腿肌的滴水损失均显著增加(p<0.05)。有研究发现,氧化油脂中含有大量自由基和醛酮类脂质过氧化物,这些有害物质的大量存在会攻击细胞膜,造成细胞膜的氧化损伤,最终导致细胞膜通透性发生变化,胞液外流,滴水损失增加,营养价值降低[2]。细胞膜的完整性和滴水损失密切相关,禽类肌肉细胞膜含磷脂量较高,极易被氧化,最终导致肉品质下降[18]。因此,饲喂黄羽肉鸡含有氧化豆油的日粮58 d,会使黄羽肉鸡胸肌腿肌肌肉的滴水损失显著增加。此外,腿肌肉色b*显著降低,其它指标差异不显著。此结果同样表明,肉品质稳定性受到了影响,肉色b*的影响最为显著,这可能与黄羽肉鸡品种特性有关,关于氧化油脂对黄羽肉鸡肉品质方面影响及其背后的作用机制还有待进一步的研究。

表3 BHT与氧化豆油对黄羽肉鸡胸肌肉品质的影响Table 3 Effects of BHT and oxidized oil on breast meat quality of yellow-feathered broilers

由表3、表4数据可知,与不含BHT日粮组相比,含BHT日粮组黄鸡胸肌腿肌24 h滴水损失显著降低(p<0.05),胸肌肌肉蒸煮损失显著降低(p<0.05),其他指标影响不显著(p<0.05)。滴水损失可以反映出禽肉在储存过程中品质的稳定性。鸡肉由于其脂肪酸含量和组成特性,易于发生脂质氧化[18]。脂质氧化一般包括三个阶段:起始,传播和终止,一些促氧化物以及活性氧自由基的增多均能开启脂质氧化,在没有抗氧化物质存在或体内抗氧化酶活力低下等情况下,脂质氧化反应将持续进行并难以终止[9]。研究表明,BHT能够在脂质氧化第二阶段,通过清除链过氧化自由基或抑制新自由基形成的方式,阻止脂质的进一步氧化[9]。近年来研究发现,肉鸡日粮中添加抗抗氧化剂,能够通过提高肌肉组织抗氧化能力,起到稳定肉品质的作用[19-21]。因此,本试验认为,日粮中抗氧化剂BHT的添加,也能一定程度上通过对肌肉抗氧化状态的调节,缓解脂质过氧化造成的氧化损伤,改善肌肉肉品质,减少肌肉水分和养分的流失,但其在改善肉品质方面的作用机制还需要更为深入的研究。

表4 BHT与氧化豆油对黄羽肉鸡腿肌肉品质的影响Table 4 Effects of BHT and oxidized oil on thigh meat quality of yellow-feathered broilers

2.2 氧化豆油与BHT对黄羽肉鸡肌肉MDA含量以及抗氧化能力的影响

表5 BHT与氧化豆油对黄羽肉鸡胸肌抗氧化能力的影响Table 5 Effects of BHT and oxidized oil on breast muscle antioxidative status of yellow-feathered broilers

表6 BHT与氧化豆油对黄羽肉鸡腿肌抗氧化能力的影响Table 6 Effects of BHT and oxidized oil on thigh muscle antioxidative status of yellow-feathered broilers

GSH作为体内非酶内源性抗氧化物,其水平的变化能够机体的氧化还原状态。T-AOC是能够反映机体总抗氧化能力的另一项重要指标。由表6数据可知,与新鲜豆油组相比,氧化豆油组黄羽肉鸡腿肌GSH含量和T-AOC显著降低(p<0.05)。试验结果表明,长期饲喂氧化豆油能够使黄羽肉鸡机体氧化还原状态变差,肌肉抗氧化能力降低。Liang等[27]在研究氧化大豆油对黄羽肉鸡肠道氧化应激时,认为T-AOC(评估氧化还原状态的指标)的下降能够表明机体内存在自由基产生和消除不平衡的现象,此研究结果与本试验研究结果基本相似。

由表6油脂与日粮互作结果可知,日粮中BHT的添加能够显著缓解由氧化豆油引起的腿肌肌肉内SOD含量的降低(p<0.05)。SOD活力的升高往往会导致H2O2在体内的积聚,CAT能够清除SOD活性引起的过氧化氢的分解。因此,本试验认为腿肌CAT活力的显著升高,可能与SOD活力的增加有一定相关性。Ighodaro等[12]在研究BHT对大鼠肝脏氧化损伤作用时,发现BHT在体内是通过调控CAT活性来抑制脂质过氧化,尽管物种不同,此结果与本试验结果相似。

综上所述,本研究认为日粮中添加BHT能够通过调节CAT活性来降低肌肉中MDA含量,即饲喂BHT有益于抑制脂质进一步氧化,缓解由氧化豆油引发的氧化损伤,提高肌肉组织的抗氧化能力。然而,BHT在肌肉中的抗氧化调控机制还有待进一步研究与讨论。

2.3 氧化豆油与BHT对黄羽肉鸡肌肉抗氧化相关基因转录水平的影响

GSH作为细胞内重要的非酶抗氧化物,其生物合成是在两个ATP依赖性反应中进行的。谷氨酸半胱氨酸连接酶(GCL)是催化其合成的第一速率限制反应,该酶是催化亚基(GCLc)和修饰亚基(GCLm)组成的一个异二聚体[30]。因此,GCL的活性对GSH的合成起重要作用,而GCLc和GCLm在转录水平mRNA的表达及翻译水平蛋白质的表达量能够在很大程度上决定GCL活性。表7、表8数据显示,与新鲜豆油组相比,氧化豆油组黄羽肉鸡腿肌γ-GCLc mRNA表达量和γ-GCLm mRNA表达量都会显著降低(p<0.05),对其他指标无显著影响(p>0.05)。此试验结果与表6中,受氧化油脂影响,腿肌肌肉GSH含量显著降低的结果相呼应,共同证明了氧化豆油对黄羽肉鸡腿肌肌肉非酶系统的影响,使机体的氧化还原状态遭到破坏。

表7 BHT与氧化豆油对黄羽肉鸡胸肌抗氧化基因表达量的影响Table 7 Effects of BHT and oxidized oil on breast muscle mRNA abundance of genes related to oxidative status of yellow-feathered broilers

表8 BHT与氧化豆油对黄羽肉鸡腿肌抗氧化基因表达量的影响Table 8 Effects of BHT and oxidized oil on thigh muscle mRNA abundance of genes related to oxidative status of yellow-feathered broilers

作为基础亮氨酸拉链转录因子家庭成员之一[32],Nrf2是细胞氧化应激反应中的关键因子,在不同物种间高度保守,并且广泛存在于机体组织和细胞中。研究表明,在氧化应激条件下Nrf2能够通过抗氧化剂反应元件介导的几种二相解毒和抗氧化酶(HO-1、GPX1、SOD1和CAT等)诱导细胞抵抗氧化应激,从而保护组织和细胞免受氧化损伤[32]。由表7、表8互作数据可知,日粮中添加BHT,对由氧化豆油引起的Nrf2 mRNA 表达量下调,有显著的缓解作用(p<0.05)。试验结果表明,氧化豆油致使黄羽肉鸡肌肉中发生了氧化应激,本试验中BHT能够通过Nrf2途径调节相关酶活,提高肌肉抗氧化。SOD1是T-SOD重要代表性基因之一,肌肉中CAT mRNA表达量的高低与肌肉中CAT酶活力高低密切相关。表7、表8其余抗氧化基因数据结果显示,与不含有BHT日粮组黄羽肉鸡相比,含有BHT日粮组黄羽肉鸡肌肉中SOD1和CAT mRNA表达量显著上调(p<0.05)。

此结果与本试验表5、表6结果之间相互印证,表明BHT能够通过调节肌肉抗氧化酶活,提高黄羽肉鸡抗氧化能力,缓解氧化油脂带来的氧化损伤。然而,BHT提高黄羽肉鸡肌肉抗氧化能力的具体机制还有待更进一步的研究。

3 结论

本试验结果表明,氧化豆油能够导致黄羽肉鸡肌肉滴水损失的增加,肌肉MDA含量显著升高,抗氧化酶活和相关基因mRNA表达量下降。日粮中BHT的添加能够显著降低滴水损失,降低MDA含量,提高机体CAT酶活力,上调机体抗氧化基因的mRNA表达。上述结果提示,氧化豆油能够导致黄羽肉鸡肉品质的降低,造成肌肉氧化损伤,致使抗氧化系统的破坏;日粮中125 mg/kg BHT的添加,能够显著改善肉品质,通过调节肌肉内抗氧化功能,达到缓解氧化损伤的目的。