大连黑松松材线虫的调查、分离与鉴定

王珏，李霜雯，吕晓亮，田宇明

(大连市现代农业发展服务中心,辽宁 大连 116023)

松材线虫病(PWD)是由松材线虫侵染引起，一段时间内可以使松树枯死的一种严重森林病害，该病又称为松材线虫萎蔫病、松树萎蔫病、松树枯萎病，被称为“松树的癌症”[1]，具有发病致死速度快、传播蔓延迅速、防治难度大等特点，是严重威胁全世界林业生产的重大检疫性病害之一[2]。松材线虫病最早于1905年在日本九州长崎发现，于1982年首次在我国南京市中山陵黑松上发现[3]，于2016年在大连沙河口区大顶山发现。由于黑松是大连市南部风景林和沿海防护林的主要树种，而黑松又是松材线虫病的易感染树种，疫情得不到良好的控制，将直接威胁大连市6.7万hm2松林的安全。由于该病由松材线虫引起，目前国内外尚无很好的根除方法，唯有通过早期诊断和检测，设立和建设无病区，快速清理疫木以防疫情扩散[4]。松材线虫的传统检测技术如形态学等方法在检测过程或多或少存在一定的局限性[5]，分子检测技术则具有快速、特异、灵敏的特点[6]，本研究首次对大连地区黑松枯萎病发病情况进行广泛调查并对病原线虫进行多方面鉴定，以期为松材线虫病未来的防治提供相应依据。

1 材料和方法

1.1 调查地点及采样方法

2017年10月到2018年3月，对辽宁省大连市黑松枯死的7个典型地区作为样地进行调查(滨海路西段、动物园、中山青云林海、中山棒棰岛、西岗捷山、沙河口大顶山、甘井子翡翠春城)，采用系统抽样方法进行样本的采集，每10～15 m确定一株枯死树进行采样。本次调查共采集494株黑松样本，用于分离鉴定病原松材线虫。测量记录每株样木的胸径和树高，采样部位为样木坡下方向距地1.3 m胸高处，采集量约80 g，装入标本袋，及时将样品冷藏待检。

1.2 线虫的分离

采用贝尔曼漏斗法[7]，将采集的木样劈成长度小于1 cm，宽度小于0.5 cm的小木块，每个样品取样7.5 g，重复3次，单层纸巾包好，纯净水浸泡12 h，漏取2 mL左右线虫悬浮液放入离心管中，吸取管底线虫液用于形态鉴定和分子生物学鉴定。分离过后的木块、多余蒸馏水和漏斗进行120 ℃高温无害化处理。

1.3 形态鉴定

用100 μL移液枪吸取离心管底部线虫悬浮液滴至载玻片，解剖镜下挑取雌、雄虫各1头以上，将其置于酒精灯火焰上方加热3～5 s，线虫加热杀死后加盖玻片，制成临时玻片，于显微镜下观察线虫主要形态特征(口针、食道球、阴门、阴门盖、交合刺、交合伞与尾端形态等)并进行初步鉴定。

1.4 分子生物学鉴定

用10 μL移液枪在显微镜下挑取形态无法确定的线虫，从TAKARA公司购买DNA制备试剂盒，按照试剂盒要求步骤提取线虫DNA，进行PCR扩增和测序。PCR扩增反应体系共50 μL，包括正反引物各2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 35.75 μL，dNTP Mix 4 μL，dTaq酶0.25 μL，10×Taq Buffer 5 μL。松材线虫特异性引物为东北林业大学松材线虫实验室赠送(上游引物：GATGGCGGTTCGATTCGCG,下游引物：TGGCTGGTCTCATCTGTCGG)。扩增程序为：95 ℃，3 min；95 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min；采用2%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行电泳分离，电泳缓冲液为1×TAE，电压为130 V，电流为130 mA ，分析DNA片段的长度，观察并照相。将PCR扩增产物送上海生化公司双向测序。登录NCBI网站中的BLAST页面将测序结果与已登录的序列进行比对。

2 结果与分析

2.1 线虫鉴定结果

2.1.1 形态观察结果 成虫头部均具有明显的溢缩，具口针和中食道球。雄虫热杀死后虫体呈“J”形，强烈腹弯，侧面观呈爪状，体前端与雌虫相似，尾部有交合刺，尾端尖细，交合刺弓状，成对，基顶高圆，喙突锐尖、交合刺远端具小盘状突，尾端腹面观可见交合伞，多呈卵圆形，形态多变。雌虫热杀死后虫体略向腹面弯曲，成大写的C形，唇区高，溢缩显著，口针细长，基部略膨大，中食道球卵圆形，鳄梨状，占体宽2/3左右，瓣门清晰，阴门位于虫体中后部，大约体长70%处，阴门盖明显，像指甲形，附在阴门上，尾部指圆形，无尾尖突。

形态观察结果表明，雌虫和雄虫的形态特征符合松材线虫的鉴定特征，由于松材线虫的雄虫和拟松材线虫的雄虫形态很接近，因此辨认松木内松材线虫的主要依据是雌虫。

图2 部分PCR凝胶电泳

2.1.2 分子鉴定结果 选择松材线虫序列特异性引物，以黑松疑似松材线虫的DNA为模板进行PCR扩增和测序，获得完全一致的序列,测序结果片段为105 bp。将序列在NCBI上比对结果显示，黑松中分离的线虫与松材线虫多个登录序列相似度为100%(如MK：292122.1)。综上所述，以上分子测序结果结合样地中黑松受害特征和松材线虫特征，综合判断大连地区黑松枯萎病原线虫为松材线虫。

图3 部分PCR产物序列结果

图4 NCBI在线比对部分结果

2.2 松材线虫调查结果

为全面了解大连地区松材线虫病情况，本次调查涉及中山区、西岗区、沙河口区、甘井子区四个行政区，在各区具有代表性的地块内选择7个样地，涉查面积合计约57.5 hm2。调查结果见表1。调查的枯死黑松数量为494株，通过形态观察和分子生物学鉴定，其中有79株黑松有松材线虫，每个地区线虫检出率差异较大，有松材线虫株率平均为16.0%。

表1 各样地黑松枯死调查结果

3 结论与讨论

黑松较耐寒、耐干旱、耐瘠薄及对盐碱土抗逆性较强，较抗海风，也可在海滩盐土地方生长，耐海风和海刹，能与多种树构成针阔混交林，在沿海造林总体表现较好。大连地区的黑松原产日本，从山东舟山群岛引入到大连已有70多年历史，经过几十年的引种栽培，已形成了大连地区风景林和沿海防护林主林带，为大连生态建设和林业发展起到了重要作用[8]。

调查明确了大连地区2017—2018年黑松感染松材线虫的基本状况，本次调查涉及大连各区具有代表性的地块，通过形态观察和分子生物学鉴定，结合样地中黑松受害特征和松材线虫特征，综合判断大连地区黑松枯萎病原线虫为松材线虫，在抽样的黑松中感染率平均为16.0%。自2016年大连市在黑松上发现松材线虫以来，已经造成上千亩松树死亡，且尚无很好的根除方法，因此为防止大连市松材线虫病疫情扩散，保障大连市森林生态安全，加强病害的早期诊断和检测技术尤为重要[9]。针对松材线虫病的防治还需在前期鉴定方法方面进行进一步研究，以期在未来检测中缩短鉴定时间和简化实验方式。