发酵温度对柑橘酒品质的影响

毕静莹，李 华*，王 华*

（1.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西 杨凌 712100；2.宁夏职业技术学院生物与制药技术系，宁夏 银川 750021）

2016年中国的柑橘栽培面积为255.67万 公顷、产量3 618.80万 t，分别为同期世界柑橘栽培面积（8 8 0.8 9万 公顷）、产量（1 3 5 0 0万 t）的2 9.0 2%和2 6.7 9%，我国柑橘栽培面积和产量已双双久居全球之冠[1]。如此大的柑橘种植面积和产量，深加工能力却仅占产量的5%，低于世界平均水平35%，与中国台湾80%～90%的加工水平更是相去甚远[2]。

柑橘酒的“后苦”、高酸和香气寡淡等感官缺陷，严重制约着其市场的推广和生产规模的扩大。“后苦”即柑橘果实在经受冻害、挤压碰撞、压榨取汁后，在pH值小于6.5的条件下，柑橘果实中无苦味的前体物质柠檬苦素A-环内脂在柠檬苦素D-环内脂水解酶的作用下转化成为具有苦味、阈值极低的柠檬苦素类似物[3]。香气是评判果酒品质的一个重要感官指标，其主要包括醇类、酯类、酸类和醛酮类[4]等，构成果酒品种、发酵和陈酿香气。柑橘酒香气成分的种类、含量、阈值及其相互作用是影响柑橘酒风格和品质的主要因素，可作为感官评价的重要依据。

目前对柑橘酒的研究主要集中在3 个方面，首先是通过感官评价[5-6]、理化和卫生指标[7]、气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[8-9]对柑橘酒香气的检测等方面指导工艺优化；其次是从柑橘果实表面[10-11]、橘园土壤[10-13]、自然发酵柑橘汁[13-15]、腐烂果实[16]和果肉[17]中分离筛选出适宜于柑橘酒酿造的专属酵母；第三是柑橘与其他果品，例如苹果[18]、石榴[19]、佛手[20]等进行复合果酒的酿造。而针对柑橘酒生产存在的实际问题，通过理化指标、颜色、香气成分、“后苦”类物质种类及含量等感官指标的检测和分析达到优化柑橘酒酿造温度的研究鲜见报道。

本研究以四川渠县产脐橙为原料，依据李华[21]小容器酿酒技术，手工剥皮、去籽后采用气囊压榨取汁，上清液中加入葡萄酒酿酒酵母，选择10、14、18、22、26 ℃和30 ℃进行控温发酵酿造柑橘酒。采用分光光度法检测酒样在450、520、570 nm和630 nm[22]波长处的吸光度，评价颜色；通过搅拌棒吸附萃取（stir bar sorptive extraction，SBSE）法提取柑橘酒中的香气成分，再辅助热脱附-GC-MS联用仪定性定量分析香气成分构成和含量；利用超高效液相色谱法测定酒样中“后苦”类物质的种类及含量。通过本研究了解发酵温度对柑橘酒感官影响的基本规律，为优化酿造工艺、推广及规模化生产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脐橙（平均成熟度：可溶性固形物质量分数11.90%，总糖质量浓度（以葡萄糖计）58.46 g/L，总酸质量浓度（以柠檬酸计）7.20 g/L，pH 3.63，出汁率41.72%）于2014年12月底、2015年12月中旬采自四川渠县华橙酒业有限公司柑橘园。

葡萄酒酿酒酵母BV818 安琪酵母股份有限公司；柠檬苦素、诺米林、2-辛醇（均为色谱纯） 美国Sigma公司；氢氧化钠、葡萄糖、五水合硫酸铜、酒石酸钾钠、邻苯二甲酸氢钾（分析纯）、偏重亚硫酸钾广东光华科技股份有限公司。甲醇、乙腈（均为色谱纯）赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.2 仪器与设备

PAL-1数字手持式折射仪 日本ATAGO公司；ET18滴定仪 梅特勒-托利多国际贸易有限公司；Cary 60 UV-Vis紫外分光光度计 安捷伦科技有限公司；5804R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；UPLC I-Class超高效液相色谱（配有二极管阵列检测器、Empower色谱工作站）、ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）、Sep-Pak Plus C18固相萃取小柱 美国Waters公司；85-2数显恒温磁力搅拌器 杭州仪表电机有限公司；TRACE DSQ GC-MS联用仪 美国Thermo Finnigan公司；DB-Wax色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国J&W公司。

1.3 方法

1.3.1 酿造工艺流程

柑橘酒酿造工艺：原料采收→筛选→剥皮→压榨与果核分离→发酵→陈酿。

操作要点：完熟柑橘原料，人工挑选出不合格果实及杂质，手工剥皮、去籽后，料理机打浆导入20 L干净的广口玻璃罐，加入50 mg/L SO2，采用小容器酿造法进行柑橘酒的酿造。在低于10 ℃的条件下澄清24～48 h，取上清液，升温至设定温度，按照200 mg/L添加活性干酵母，以发酵终乙醇体积分数12%～13%进行加糖，进行控温发酵。当发酵液残糖质量浓度低于2 g/L时倒罐，添加50 mg/L SO2，满罐密闭10～14 d进行陈酿，陈酿过程中游离SO2保持在30～40 mg/L之间。

1.3.2 指标的测定

1.3.2.1 理化指标

总浸出物、还原糖（斐林试剂滴定法，以葡萄糖计）、滴定酸（氢氧化钠滴定法，以柠檬酸计）、乙醇体积分数（密度瓶法）、pH值（pH计测定）、多酚（福林-肖卡法）的测定方法参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》及王华[23]方法。

1.3.2.2 柠檬苦素类似物

柠檬苦素类似物的提取：采用刘棠等[24]的方法，有改动。先用2.0 mL甲醇活化Sep-Pak Plus C18固相萃取小柱，再用2.0 mL去离子水平衡。将柑橘酒于10 ℃、8 000×g离心15 min后取1 mL上清液上样于Sep-Pak Plus C18微固相萃取小柱，用1 mL去离子水淋洗后用1 mL 60%乙腈溶液进行洗脱，收集洗脱液，过0.22 μm滤膜后备用。

超高效液相色谱条件：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），柱温30 ℃，流速0.3 mL/min，进样量1.0 μL，流动相：乙腈-超纯水（45∶55，V/V）进行等度洗脱，样品运行时间3 min，色谱柱平衡时间2.1 min，检测波长215 nm。

1.3.2.3 颜色

柑橘酒的颜色采用CIELab颜色空间进行评价[22,25-26]。柑橘酒样品经过离心后用0.45 μm滤膜过滤，置于0.1 cm石英比色皿中，采用紫外-可见分光光度计连续扫描200～700 nm波长紫外-可见光谱段，扫描间隔为1 nm，蒸馏水为空白。根据光谱值找出450、520、570、630 nm波长处的4 个吸光度，根据公式（1）～（3）计算L*、a*、b*值[22]；然后再根据公式（4）～（6）计算出C*、H*和E*值[27]：

式中：X、Y、Z分别为根据国际光学委员会（CIE）推荐的公式计算出200～700 nm波长范围内的红、绿、黄三原色刺激值；X10、Y10、Z10分别为CIE推荐的标准白光的颜色三刺激值（X10=94.825；Y10=100；Z10=107.381）。

1.3.2.4 香气成分

采用SBSE-GC-MS法对柑橘酒中的香气成分进行测定[28]，香气物质萃取方法略作修改。取20 mL柑橘酒到50 mL样品瓶中，添加60 μL 2-辛醇（0.552 g/L）内标物和搅拌棒，密闭样品瓶，置于磁力搅拌器上，室温萃取1 h，然后进行GC-MS分析。

1.3.2.5 感官评价

柑橘酒感官量化分析采用文献[29]的方法进行。品尝小组由26 名葡萄酒专业的柑橘酒苦味品鉴成员构成，感官分析前用葡萄酒标准香气物质和柑橘酒特征苦味物质进行嗅觉和味觉的训练，直至特征香气及苦味物质辨别分析结果偏差小于整体平均值的5%。要求用葡萄酒标准香气的5～6 个特征词汇描述样品香气特征，并用五点标度法对所有感官特征进行量化，通过使用频率和强度均分的几何平均数[29-32]表示香气特征的量化强度（modified frequency，MF）值，计算如式（7）所示：

式中：F为某一特征打分值大于0的品尝小组成员人数占总体品尝小组成员的百分数/%；I为某一特征分值平均数占最大分值（5 分）的百分数/%。

1.4 数据分析

利用Excel和SPSS 18.0进行数据处理及统计分析，结果表示为 ±s。采用Origin 8.6.0进行绘图。GC-MS分离得到香气成分质谱数据经计算机检索NIST library（11）、Wiley library（version 6.0）及香精香料标准谱库进行定性。

定量：以2-辛醇为内标半定量。按式（8）、（9）计算：

2 结果与分析

2.1 发酵温度对酿造柑橘酒品质指标的影响

表1 不同发酵温度酿造柑橘酒的理化指标、颜色和“后苦”类物质Table 1 Physicochemical properties and DB substances of citrus wines fermented at different temperatures

在一定范围内，温度越高，酵母菌的发酵速率越快，到达发酵终点的时间就越短。由表1可知，不同发酵温度，柑橘酒总浸出物差异显著，14 ℃最低，30 ℃最高，可见温度升高有利于总浸出物质量浓度增加，10 ℃时因为发酵时间较长，故总浸出物质量浓度较高；总酸差异显著，14 ℃最低，18 ℃偏高，22 ℃最高；pH值在14、18、22 ℃和30 ℃较接近；多酚含量呈现降低趋势，可见温度越高越不利于多酚的生成和累积。柑橘酒样品的各理化指标均符合GB 15037-2006《葡萄酒》要求。

由表1可知，不同发酵温度酿造柑橘酒的明亮度L*值在95.00～96.84之间，酒体均具有良好的光泽，10 ℃颜色最亮，22 ℃颜色最暗；a*在-2.71～-2.14之间，酒体均有绿色倾向，22 ℃较其他酒样更偏向于绿色；b*在14.52～24.09之间，酒体均偏向于黄色，22 ℃较其他酒样更黄一些；C*在14.68～24.24之间，22 ℃较其他酒样颜色最集中、色彩饱和度最高；色调角H*在-1.46°～-1.42°之间，所有酒样均有稍微的蓝色色调；E*在97.71～98.14之间，随着温度升高，E*呈现升高的趋势，各酒样之间具有一定的色彩差异。结合感官评定结果，随着发酵温度的升高，柑橘酒颜色呈现加深的趋势，从淡黄色到禾秆黄，再到清淡琥珀色。

柠檬苦素的标准曲线方程为Y=2 583.6X+6 223.4（R2=0.996 4）；诺米林的标准曲线方程为Y=1 882.9X+1 554.6（R2=0.999 2）。由表1可知，不同发酵温度酿造柑橘酒中“后苦”类物质只有柠檬苦素，而诺米林未检出，随着温度升高，柠檬苦素含量呈现先降低后升高的趋势，18 ℃含量最低，14 ℃次之，30 ℃最高。可能低温和高温均有利于“后苦”类物质的累积。

2.2 发酵温度对柑橘酒香气成分的影响

柑橘酒香气主要来自于脐橙果实、酵母发酵及陈酿等过程。通过表2可知，不同发酵温度酿造的柑橘酒中共鉴定出72 种香气物质，包括酯类30 种、醇类3 种、萜烯类11 种、酸类6 种、醛酮类8 种和其他14 种，含量分别占检出组分的41.67%、4.17%、15.28%、8.33%、11.11%和19.44%。

10、14、18、22、26 ℃和30 ℃发酵酿造柑橘酒中，香气成分种类分别为36、42、47、44、45 种和48 种，香气总量分别为5 027.49、10 632.86、10 754.75、7 901.29、7 220.96 mg/L和5 863.73 mg/L。随着发酵温度升高，香气成分种类增加，总量先升高，18 ℃达到最大量后又逐渐降低。由此可见，适宜的发酵温度有利于香气成分种类及总量的增加。

2.2.1 酯类物质

醇和酸的酯化反应产生大部分的酯类香气，给予柑橘酒新鲜的，类似苹果、香蕉或菠萝等的果香[38]和鲜花的芳香[39]，是贡献较大的一类香气物质[40]。据表2可知，不同发酵温度酿造柑橘酒中酯类物质共检测出30 种，随着温度升高，依次检测出15、20、21、19、19 种和20 种，含量所占比例分别为47.27%、47.45%、45.68%、36.47%、35.65%、34.83%，呈现先升高后降低的趋势。18 ℃酯类物质种类最多，其次是14 ℃；14 ℃酯类物质所占比例最大，其次是10 ℃和18 ℃。可见，适宜的发酵温度会蓄积更多的酯类物质。

2.2.2 醇类物质

醇类物质主要来源于酵母的代谢、糖苷类香气前体和酯的水解[41]，是柑橘酒的第2大类香气物质。由表2可知，随着发酵温度的升高，醇类物质质量浓度分别为966.78、1 971.66、2 832.35、2 787.90、2 681.41 mg/L和2 346.10 mg/L，呈现先上升后下降的趋势，与肖作兵等[42]的研究一致，18 ℃为最高，22 ℃次之，10 ℃最低；醇类物质含量所占比例分别为19.23%、18.54%、26.34%、35.28%、37.13%、40.01%，呈现先下降再上升的趋势。适宜的发酵温度有利于醇类物质的形成和累积。

适当高级醇总量（＜300 mg/L）可增加葡萄酒香气的复杂性，而较高质量浓度（＞400 mg/L）则会赋予葡萄酒较重的化学味，破坏葡萄酒的感官品质[43]。结合柑橘酒感官评价结果发现这种破坏性在柑橘酒中并没有显现。

2.2.3 酸类物质

酸类物质本身就是香气成分。挥发性酸主要来源于乙醇发酵[44]。由表2可知，随着发酵温度的升高，酸类物质所占比例分别为10.00%、23.64%、17.98%、14.57%、12.35%、9.02%，呈现先上升（14 ℃达到最大）后下降的趋势；随着发酵温度升高，乙醇发酵呈现上升趋势，当温度超过酵母最佳繁殖温度时，乙醇发酵便开始下降；再加上高温会降低挥发酸的累积，比例呈现下降趋势。

图1 前2 个主成分上不同温度酿造柑橘酒香气化合物的载荷和温度分布图Fig. 1 Loadings plot of PC2 versus PC1 for aroma components of citrus wines fermented at different temperatures

2.2.4 醛酮类物质

醛酮类物质主要由酸的脱羧[45]和醇的氧化形成[46]。随着发酵温度的升高，醛酮类所占比例分别为20.20%、8.07%、8.18%、11.88%、12.96%、13.68%，呈现先下降再上升的趋势。较低温度较长时间的发酵，有利于醛酮类物质累积。2.2.5 其他

萜烯类所占比例为1.29%～2.83%，其他类为0.28%～1.01%，两者总和所占比例为1.79%～3.30%，无明显变化趋势。

由表2可以看出，脐橙经不同发酵温度酿造柑橘酒的香气成分中，苯乙醇、里那醇、香叶基丙酮、金合

欢醇、反式-橙花叔醇、乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、月桂酸乙酯、辛酸、月桂酸、棕榈酸等25 种香气成分是所有温度共有的，质量浓度在1.26～2 351.55 mg/L，因发酵温度的不同而有较大差异，它们可能构成脐橙酿造柑橘酒最基本的风味物质。另外，不同的发酵温度均有其特有的香气成分，10 ℃酿造柑橘酒中有2-甲基萘（2.98 mg/L）、1-棕榈酸甲基丁基酯（1.26 mg/L）和丁酸香茅酯（1.56 mg/L）；14 ℃酿造柑橘酒中有4-乙烯基愈创木酚（84.08 mg/L）和辛酸丙酯（3.66 mg/L）；1 8 ℃酿造柑橘酒中有抗坏血酸二棕榈酸酯（0.95 mg/L）、α-丁酸苯乙酯（0.77 mg/L）、乙酸庚酯（4.48 mg/L）和沉香螺醇（9.68 mg/L）；22 ℃酿造柑橘酒中只有乙酸橙花酯（9.60 mg/L）；26 ℃酿造柑橘酒中有愈创兰油烃（1.38 mg/L）、4-叔丁氧基苯乙烯（5.15 mg/L）和亚油酸（32.31 mg/L）；30 ℃酿造柑橘酒中有6,10-二甲基十一碳-5,9-二烯-2-醇（2.25 mg/L）、D-香茅醇（13.03 mg/L）、环氧化蛇麻烯（1.79 mg/L）、十二烷二酸二乙酯（3 9.8 0 m g/L）、2-辛酮（4.40 mg/L）、(-)-异长叶烯-9-酮（76.72 mg/L）和1,2,3,4,4a,5,6,8a-八氢-4a,8-二甲基-2-(2-丙烯基)-1-萘酚（3.41 mg/L）。这些物质含量均不高，特定温度会产生特定香气成分。正是因为这些挥发性成分及相互之间微妙的量比关系，才形成了不同发酵温度酿造柑橘酒所特有的气味。

表2 不同发酵温度酿造柑橘酒的香气成分Table 2 Aroma components of citrus wines fermented at different temperatures

续表2

如图1所示，选择气味活性值大于1，对柑橘酒香气贡献[31]较大的29 种香气成分进行主成分分析，提取出的前2 个主成分累计贡献率占总变量的51.66%和23.38%，其中，横坐标解释51.66%的变量，纵坐标解释23.38%的变量以横坐标为基准，10、14 ℃和18 ℃明显区别于其他3 个温度。18 ℃的发酵条件位于第1象限，与其密切相关的挥发性物质有乙酸异戊酯、丁二酸二乙酯、辛酸甲酯、苯乙醇、异戊醇等13 种，这些物质主要赋予柑橘酒玫瑰和蔷薇等花香，香蕉和葡萄等果香，甜香、醇香和苦杏仁味；14 ℃的发酵条件位于第4象限，与它相关的挥发性物质有乙酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯、月桂酸乙酯、里那醇等11 种，香气效果主要为玫瑰等花香，草莓、香蕉、麝香葡萄和酸水果等果香，和一定的甜香、茴香和蜡味；10 ℃位于第3象限内，与之相关的挥发性物质仅有β-紫罗兰酮；22 ℃、26℃和30 ℃位于第2象限内，和这些温度相关的挥发性物质有苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、2-辛酮和D-香茅醇。

2.5 发酵温度对柑橘酒感官品鉴的影响

从图1、表3和表4可知，14 ℃和18 ℃所酿柑橘酒在香气特征和感官特征方面整体优于10、22、26 ℃和30 ℃所酿柑橘酒。18 ℃所酿柑橘酒具有良好的感官呈现和整体平衡性，优雅的果香和花香，较其他酒样更具复杂性。

表3 不同发酵温度酿造柑橘酒样品的香气特征MF值Table 3 MF of aroma characteristics of citrus wines fermented at different temperatures %

表4 不同发酵温度酿造柑橘酒样品的感官特征MF值Table 4 MF of sensory characteristics of citrus wines fermented at different temperatures %

3 结 论

本研究以四川渠县产脐橙为原料，10、14、18、22、26 ℃和30 ℃进行控温发酵，对所酿柑橘酒的基本理化和感官指标进行对比研究。结果表明：发酵温度对柑橘酒理化指标有一定的影响，随着发酵温度的升高，总浸出物质量浓度增加，多酚含量降低，总酸和还原糖差异显著，乙醇体积分数、pH值差异不明显；酒体颜色逐渐加深，从淡黄色到禾秆黄，再到清淡琥珀色。14 ℃呈现诱人的禾秆黄色，18 ℃颜色稍深；“后苦”类物质只有柠檬苦素检出，含量呈现先降低后升高趋势，18 ℃含量最低，14 ℃次之，可能低温和高温均有利于“后苦”类物质稳定的存在。随着发酵温度的升高，香气成分种类增加，总量呈现先升高，18 ℃达到最大量后又逐渐降低。18 ℃所酿柑橘酒，酯类、醇类等优质香气成分种类及含量均最高且结构合理，呈现柑橘酒所特有的柚子、苹果、水蜜桃、菠萝等果香，茉莉等香甜的花香，轻微的苦杏仁及青椒的香气。主成分分析和感官评定结果表明：发酵温度与香气物质之间存在着一定的相关性，不同的酿造温度会产生该温度下柑橘酒所特有的香气成分，故14 ℃和18 ℃所酿柑橘酒整体较优，18 ℃所酿柑橘酒更具复杂性。