以‘巨玫瑰’葡萄为母本的胚挽救育种研究

郭艳芳，张娜，田淑芬*，月丫

（1. 天津师范大学生命科学学院，天津 300387；2. 天津市设施农业研究所/天津市葡萄遗传与育种企业重点实验室，天津 300192；3. 天津农学院，天津 300384）

利用胚挽救技术以二倍体和四倍体葡萄为材料杂交育种是获得三倍体无核葡萄最有效的方法[1]。山下裕之等[2]利用四倍体和二倍体的有核葡萄杂交，经胚挽救后代成苗率达42.4%，且四倍体葡萄为母本比二倍体为母本获得的后代三倍体的比例高。‘巨玫瑰’葡萄是以沈阳‘大粒玫瑰香’为母本、‘巨峰’为父本杂交育成的四倍体大粒欧美杂交品种[3]，被称誉为集‘巨峰’葡萄的抗性和‘玫瑰香’葡萄的优良品质于一体的超亲本葡萄新品种[4]。该品种广受民众喜爱的鲜食葡萄，但果实有核食用起来不方便，因此将其无核化有利于其进一步推广栽培。‘玫瑰香’葡萄适应性强、果味香甜、多汁，具有浓郁的玫瑰香味；‘黄玫瑰’葡萄肉质硬脆，有玫瑰香味，可溶性固形物15.03%，将‘巨玫瑰’与‘玫瑰香’‘黄玫瑰’葡萄进行杂交有望育出大粒、无核、有香味的优质鲜食品种。本试验以四倍体‘巨玫瑰’品种为母本，以二倍体‘玫瑰香’和‘黄玫瑰’为父本，利用胚挽救技术探索最适杂交亲本、最佳取样时间和最适胚发育培养时间，以期培育出大粒、无核、有香味的葡萄新品种。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2018年4—12月在天津市农业科学院现代农业创新基地和天津市葡萄遗传与育种企业重点实验室进行，材料选自天津市农业科学院现代农业创新基地，胚挽救杂交组合设置见表1。

表1 胚挽救杂交组合设计Table 1 The hybridization crosses of seedless grapes

1.2 方法

1.2.1 花粉采集

于2018年4月中旬进行，待5%左右的小花开放时，进行花粉采集，选取生长健壮、饱满的花穗，用镊子除去发育差和已开放的花蕾，剥离花药于硫酸纸上自然条件下阴干，包好放进盛有干燥剂的试剂瓶中，做好标记，存于4 ℃冰箱备用[5]。

1.2.2 去雄授粉

2018年5月12日对发育程度一致、健壮的‘巨玫瑰’葡萄小花进行人工去雄，用镊子小心的将花冠连同花药一起去掉，确认整穗全部去雄后套袋，每组合去雄15穗；待柱头开始分泌黏液时授粉（约去雄后1～2 d），授粉前将花粉碾碎，授粉时间为每天上午9∶00—10∶00和下午3∶00—5∶00，连授3 d，每次授粉后即刻套袋，标注好授粉时间和杂交组合[6]。

1.2.3 室内胚挽救

（1）幼果采集与消毒。采集授粉后49 d、54 d、61 d的果实，去果柄，先在自来水下冲洗15 min，然后在无菌超净工作台上用75%酒精消毒30 s，无菌水冲洗3次，再在2%的次氯酸钠溶液中浸泡3 min，无菌水冲洗3次。

（2）胚发育培养。将消毒后的果粒切开剥出胚珠，接种在盛有N1（Nitsch﹢1.5 mol/L IAA﹢0.5 mol/L 6-BA﹢0.5 mol/L GA3﹢60 g/L蔗糖﹢5 g/L琼脂﹢1 g/L活性炭）培养基（pH=5.8）的250 mL三角瓶内，每瓶接种15粒，于（25±2）℃培养室内培养，培养60 d后，统计胚发育率。

（3）胚萌发培养。无菌环境下取发育培养65 d、80 d、95 d的胚珠，剥出亮白色的胚，接种到W1（WPM﹢0.2 mg/L 6-BA﹢30 g/L蔗糖﹢5 g/L琼脂﹢1.5 g/L活性炭）培养基（pH=5.8）上，于（25±2）℃培养室内培养30 d后，统计胚萌发率，培养50 d后统计成苗率。

（4）继代培养。胚萌发成苗后，将杂交苗保留1～2芽，其余部分剪成单芽茎段（使伤口面积尽可能的大），插入W1培养基上。

1.3 数据分析

胚珠离体培养60 d后统计胚发育率，胚离体培养30 d后统计胚萌发率。

实验数据均取平均值并采用WPS软件和SPSS 17.0软件对实验数据进行处理和方差分析（P＜0.05）。

胚发育率/%=（发育胚数/接种胚珠数）×100

胚萌发率/%=（萌发胚数/接种胚珠数）×100

2 结果与分析

2.1 不同父本对胚挽救结果的影响

不同父本葡萄品种对胚挽救的影响如表2。数据显示，在以‘巨玫瑰’葡萄为母本的2个杂交组合中，‘玫瑰香’作父本的杂交胚发育率和萌发率分别为14.38%和7.7%，‘黄玫瑰’作父本的胚发育率和萌发率分别为43.74%和18.75%，均显著高于前者，这说明父本基因型对胚挽救有一定的影响，以‘黄玫瑰’作父本的胚挽救效果更好。

2.2 取样时期对胚生长发育的影响

从授粉后49 d开始取样，每隔7 d取样一次，分别为花后49 d、54 d和63 d，各杂交组合相应时期的胚发育率和萌发率如表3。由试验结果可知，以‘巨玫瑰’葡萄为母本胚挽救育种的最佳取样时间为花后63 d，其中以‘玫瑰香’作父本的杂交胚发育率和萌发率可达14.38%和7.7%，以‘黄玫瑰’作父本的杂交胚发育率（43.74%）和萌发率（18.75%）均显著高于其他取样时期的胚发育率和胚萌发率。

2.3 胚发育培养天数对胚挽救效果的影响

对授粉后49 d、56 d、63 d的杂交胚珠离体培养，根据杂交胚萌发率确定最适胚发育培养时间如表4，‘巨玫瑰×玫瑰香’授粉后49 d、56 d、63 d取样的最适胚发育培养时间分别为95 d、80 d、80 d，相应时间发育率为2.67%、11.86%和16.48%；而‘巨玫瑰×玫瑰香’授粉后49 d、56 d、63 d取样的最适胚发育培养时间均为80 d，发育率分别为10.64%、12.12%和47.37%。初步得出以‘巨玫瑰’为母本杂交胚的最佳发育培养时间为80 d，可为以‘巨玫瑰’为母本的胚发育培养提供参考。

3 讨论及结论

由于三倍体葡萄植株生长势强、果粒大、果实少核或无核[7]，利用二倍体和四倍体杂交，获得新种质的方法在植物界已获得一定成果且应用很广。Tian等[8]研究表明，不同的基因型使杂交胚获得率、体胚萌发率及成苗率存在差异。在该研究中发现以‘巨玫瑰’作母本，以‘黄玫瑰’作父本的胚发育率（43.74%）和萌发率（18.75%）显著高于以‘玫瑰香’为父本的胚发育率和萌发率；不同葡萄品种的胚败育时期不同，确定胚珠的最佳取样时期，适时接种对胚挽救具有重要意义。徐海英等[9]认为胚败育时期与母本的成熟期有很大的关系，研究发现早熟品种为授粉后6～9周，中熟品种为授粉后7～10周，晚熟品种为授粉后9～12周。‘巨玫瑰’葡萄为中熟品种，‘巨玫瑰×玫瑰香’‘巨玫瑰×黄玫瑰’两杂交组合在授粉后63 d的胚发育率和萌发率均显著高于其他两个时期，即以‘巨玫瑰’为母本时最佳取样时间为授粉后63 d，实验结果与徐海英的结论一致；本实验中对‘巨玫瑰×玫瑰香’‘巨玫瑰×黄玫瑰’各时期取样胚珠发育培养65 d、80 d、95 d后，初步得出以‘巨玫瑰’为母本的胚挽救合子胚，发育培养80 d的发育程度最高，最有利于胚挽救成苗。

表2 不同父本对胚挽救结果的影响Table 2 Effects of different male parent on embryo rescue

表3 不同取样时期下幼胚生长发育情况Table 3 Growth and development situation in different sampling dates

表4 胚发育培养天数对胚挽救效果的影响Table 4 Effect of embryo development culture time on embryo rescue