转录因子Snail对胃癌MKN-28细胞的增殖、凋亡及侵袭的影响

武平

（山西医科大学晋祠学院，山西太原 030025）

胃癌属于恶性肿瘤的一种，其发生率较高，并具有较高的致死率，严重威胁患者的健康及安全[1]。研究显示，晚期胃癌患者死亡的一项重要原因即肿瘤细胞侵袭与转移。因此，了解胃癌的发生情况，同时分析其侵袭、转移机制，可为该病患者的治疗提供有效参考[2-3]。Snail是一种锌指蛋白转录因子，该因子在多种肿瘤疾病中均可发挥一定作用[4]。本研究就转录因子Snail对胃癌MKN-28细胞的增殖、凋亡及侵袭的影响进行了分析。

1 材料与方法

1.1 实验材料

自上海细胞库选购胃癌MNK-28细胞株，选取基尔顿公司合成的慢病毒构建针对Snail设计的shRNA载体；同时选取CCK-8试剂盒（生产厂家：凯基公司）、Transwell小室（生产厂家：康宁公司），顺铂及其他试剂、培养基均由博尔美公司提供。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

于37 ℃、5%二氧化碳水平下，以PRMI 1640培养基（含10%胎牛血清）对MNK-28细胞进行培养；严密观察细胞情况、定时换液，细胞密度达到80%时以胰酶消化处理，继续培养。

1.2.2 筛选药物浓度

取对数生长期的胃癌MNK-28细胞株，将选取的细胞株加至96孔板中，每孔加入100 μL悬浊液，密度设置为1×104个/mL，连续培养24 h；分别在孔中加入2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL的顺铂，培养时间分别为12 h、24 h、48 h；同时每孔中加入10 μL CCK-8；然后于37 ℃、5%二氧化碳的培养箱中继续培育2 h，之后利用酶标仪进行450 nm波长的吸光度值（OD值）测定；每组细胞均分别设置3个复孔。

1.2.3 细胞增殖情况观察

细胞增殖情况以CCK-8法观察，在96孔板中加入对数生长期的MKN-28细胞，每孔中加入细胞悬液100 μL，确保每孔细胞密度为1×104个/mL；并设置复孔，继续培养24 h，之后加入顺铂、shRNA+Snail、shRNA+Snail+顺铂等处理因素，继续进行培养；每孔加入10 μL CCK-8，于培养箱中培养2 h，以空白对照标零，利用酶标仪进行吸光度值测定。

1.2.4 细胞凋亡情况观察

以电镜观察细胞凋亡情况，在96孔板中加入密度为4×105个/mL的MKN-28细胞，并加入相关刺激因素，培养48 h，以胰酶消化细胞，离心10 min，弃上清液，以Palade缓冲液进行2次洗涤，洗涤后在1%锇酸中悬浮细胞，固定于4 ℃环境下1 h，再以相同缓冲液进行洗涤2次。之后进行脱水处理，脱水后在丙酮/包埋剂置换30 min，置换后在包埋剂中浸润2 h，之后进行包埋、切片、染色等处理，最后于电子显微镜下对细胞情况进行观察。

1.2.5 细胞侵袭情况观察

对细胞侵袭情况进行分析，观察方式选用Transwell小室，收集经相关因素刺激后的对数生长期细胞，调整细胞密度至2×105个/mL，在Transwell小室上部接种，在37 ℃环境下培养24 h；之后将Transwell膜取出，反复洗涤，并用4%多聚甲醛固定15 min，用0.1%结晶染色10 min；最后于显微镜下进行拍照观察，统计穿过Transwell膜的细胞数量。

1.3 统计学分析

以SPSS20.0统计学软件对数据资料进行处理，计量资料“±”以t检验，计数资料（%）以χ2检验，p＜0.05为有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 药物浓度筛选结果分析

以酶标仪进行OD值测量，以OD值表示细胞存活率，MKN-28细胞在经不同浓度的顺铂培养48 h后，其细胞存活率均明显降低，且随着顺铂浓度的增加，其细胞存活率逐渐下降。经分析，于5 μg/mL、作用48 h时杀伤效率最理想，见表1。

表1 药物浓度筛选结果

2.2 沉默Snail基因对MNK-28细胞增殖情况的影响

经CCK-8法对各组MNK-28细胞增殖能力进行观察，以OD值表示细胞增殖能力，作用48 h后进行比较，顺铂处理及慢病毒沉默Snail基因均可见细胞增殖抑制现象，而shRNA+Snail+顺铂组细胞增殖抑制率显著高于其他组（p＜0.05），见表2。

表2 沉默Snail基因对MNK-28细胞增殖情况的影响

2.3 沉默Snail基因对MNK-28细胞凋亡的影响

于电镜下对细胞凋亡情况观察分析，可以观察到内皮网明显稀疏，细胞质明显浓缩，内质网稀疏，并和细胞膜融合形成空泡，细胞核也明显缩小，同时线粒体体积变大，并可见已凋亡细胞发生裂解，构成凋亡小体。shRNA+Snail+顺铂组凋亡小体相较于其他组别，表现地更为明显，见图1。

图1 细胞凋亡情况观察

2.4 沉默Snail基因对MNK-28细胞侵袭情况的影响

以Transwell小室观察细胞侵袭情况，以穿过Transwell膜的细胞数量进行表示，以OD值进行计数，shRNA+Snail+顺铂组细胞迁出的细胞数较其他组明显降低（p＜0.05），见表3。

表3 沉默Snail基因对MNK-28细胞侵袭情况的影响

3 讨论

胃癌属于恶性肿瘤性疾病的一种，起源于胃黏膜上皮，其发生率较高，占据了我国各种肿瘤的首位[5]。该病患者多为50岁以上的中老年人群，且男性的发生率约为女性的2倍[6]。近年来，随着人们生活习惯、饮食结构的改变及工作压力的增大，该病的发生率呈明显增长趋势。该病发生早期通常无明显症状，极易被患者忽略，多数患者就诊时已处于晚期状态。手术是目前临床上治疗胃癌的常用方式，但术后患者复发及转移率较高，通常可达到40%～60%。而胃癌转移属于胃癌的重要特征，是导致患者死亡的重要因素[7]。故而加强对胃癌侵袭、转移的研究非常重要。

Snail属于锌指蛋白转录因子的一种，定位于人类染色体20q12.3。有研究表明，Snail在小鼠结肠癌肿瘤细胞凋亡及增殖中发挥着重要作用。同时有研究显示[8]，Snail能够调节细胞周期蛋白CyclinD2，且其异常表达还可能会影响p53及一些促凋亡因子表达情况，进而可对肿瘤生长造成影响。

本次研究分析了Snail对胃癌MKN-28细胞增殖、凋亡及侵袭的影响，结果显示顺铂处理及慢病毒沉默Snail基因均可见细胞增殖抑制现象，而shRNA+Snail+顺铂组其细胞增殖抑制率显著高于其他组（p＜0.05）；与单纯MKN-28细胞组比较，不同刺激因素组细胞凋亡程度均显著升高（p＜0.05）；这说明，Snail可对胃癌MKN-28细胞的增殖与凋亡造成影响。

胃癌细胞转移与浸润属于复杂过程，常会涉及较多方面，如细胞自原发病灶中脱落，并将基底膜浸润、穿透，细胞之间黏附力不同，可对浸润造成影响[9]等。从实质上说，癌细胞的浸润和转移是黏附和去黏附的交替过程，其和E-cadherin的表达之间密切相关。上皮间质转换则在胚胎时期器官发育过程中承担着重要职责，和肿瘤局部浸润、侵袭能力均有较大关联，而E-cadherin为上皮细胞的关键分子，其表达水平下降则为其典型表现，Snail基因则可对其表达情况进行调节[10]。本次研究结果显示，经Snail基因调节后，各组细胞侵袭能力均有所下降，且shRNA+Snail+顺铂组细胞迁出的细胞数较其他组明显降低（p＜0.05）；提示Snail可在一定程度上对细胞侵袭能力造成影响，而Snail可能会在一定程度上提高顺铂的活性。

综上所述，转录因子Snail可对胃癌MKN-28细胞的增殖情况产生影响，沉默Snail基因有利于加速细胞凋亡，提高化疗药敏感性，有较好的临床应用前景。