pH对盐酸胍/Ⅰ型胶原分散体系触变性的影响

狄雯雯，吴晓航，李艳，戴肖南

（齐鲁工业大学 化学与制药工程学院，山东济南 250353）

Ⅰ型胶原作为具有三股螺旋结构的棒状生物大分子，在生物学上具有一些优良的特征，如低免疫原性、生物可降解性及止血性等[1-2]，目前已成为生物工程材料及组织工程基底材料的首选[3-4]。

在胶原的应用过程中，胶原分子的变性及分散体系的流变性一直是人们关心的问题。本课题组曾研究了盐酸胍（GuHCl）对Ⅰ型胶原的变性作用，以及对胶原分散体系流变性的影响，发现在不同条件下，盐酸胍/Ⅰ型胶原分散体系可分别呈现出正触变性、负触变性及复合触变性特征[5]。为了系统研究胶原分散体系在变性后的流变行为，本文进一步研究了盐酸胍/Ⅰ型胶原分散体系在不同pH条件下的触变性，所得结果将有助于加深对触变性产生机理的认识。

1 实验部分

1.1 主要试剂及仪器

胃蛋白酶（活性1∶3 000）及彩虹245广谱蛋白马克（分子量范围11～245 kD），由上海索莱宝生物科技有限公司提供；GuHCl，由国药集团化学试剂有限公司提供。DHR-2型旋转流变仪（美国TA公司）、LGJ-10D型冷冻干燥机（北京四环）、GL-20G-Ⅱ型高速冷冻离心机（上海安亭）、JY-SCZ2型双垂直电泳槽（北京君毅）。

1.2 胶原的提取

采用胃蛋白酶降解法提取Ⅰ型胶原蛋白[5]。

1.3 GuHCl/胶原体系的配制

用Tris-HCl缓冲溶液（c=0.05 mol/L）配制胶原分散体系，胶原浓度为3 mg/mL；分别调节体系的pH值至酸性（pH=5.0）、中性（pH=7.2）及碱性（pH=9.0，11.0）条件；然后加入盐酸胍，使盐酸胍在分散体系中的浓度分别为0.25 mol/L、1.0 mol/L及2.0 mol/L；加入盐酸胍12 h后开始触变性测定实验。实验温度固定为（25.0±0.1）℃。

1.4 实验方法

体系触变性的测定采用DHR旋转流变仪锥板测量系统（直径40 mm，夹角2°）。先将所有样品放置在测量板上，静置10 min，然后再进行触变性的测定实验。首先，采用高速预剪切(D＝1 000 s-1，t=60 s)破坏样品体系内部原有的结构；剪切停止后，采用小幅振荡剪切法，在线性黏弹区（f=1 Hz，τ=1 Pa）考察体系结构的恢复过程：若随时间的延长，体系复合黏度|η*|的数值升高，说明体系为正触变性体系；若|η*|的数值降低，则为负触变性体系；若|η*|先升高，达到最大值后又开始降低，则为复合触变性体系。

2 实验结果与机理探讨

2.1 胶原的结构表征

提取的猪皮胶原凝胶电泳图谱如图1所示。从图谱中可以看出，胶原分子主要由二条α链（α1,α2）和一条β链组成。二条α链的分子量皆为100～135 kDa；并且α1链谱带的宽度约为α2链的2倍，颜色也较α2链深，表明胶原分子中α1链的含量约为α2链的2倍。以上凝胶电泳结果说明，所制备的胶原为典型的Ⅰ型未变性胶原。图1结果还显示，在胶原分子中还存在β链（二聚体）和γ链（三聚体），说明在胶原分子内和分子间还存在多种交联结构。此外，在体系中加入β-巯基乙醇（β-ME）后，胶原的凝胶电泳谱带没有发生改变，与原来的一致，说明胶原中不含有二硫键。

图1 胶原凝胶电泳图

所提取猪皮胶原的红外光谱如图2所示，含有5个特征吸收峰，分别是酰胺A、酰胺B、酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ及酰胺Ⅲ，分别对应于3 315、3 073、1 641、1 552及1 244 cm-1。以上结果与文献一致[6]，进一步说明所提取的猪皮胶原为Ⅰ型胶原。

图2 胶原蛋白红外光谱图

2.2 pH对胶原分散体系触变性的影响

不同pH条件下，纯胶原分散体系的触变性测定结果如图3所示。图3显示，在体系结构的恢复过程中，随着时间的延长，体系的|η*|先缓慢升高，当超过500 s（pH=5.0或pH=7.2）或超过1 000 s（pH=9.0或pH=11.0）后，复合黏度|η*|随t迅速上升，最终曲线趋于平缓，均表现为正触变性。

由文献[7]可知，通过自组装，胶原分子之间可以有序地排列成网状、层状或错列的纤维结构，这种纤维的直径和长短都会随着外界因素的改变而改变。在高速预剪切过程中，较高的外加剪切力可以部分破坏这种网络结构，表现为体系的黏度降低。在结构的恢复过程中，胶原分子之间可以重新进行自组装，缓慢形成新的网络结构，表现为体系的|η*|随时间逐渐升高，呈现出正触变性特征。

图3 pH对纯胶原分散体系触变性的影响（胶原浓度：3 mg/mL）

当pH=7.2时，3 mg/mL的纯胶原分散体系黏度值最大，酸性或碱性条件均可导致胶原分散体系黏度不同程度的下降，这与汪海波等[8]人的研究结果一致。但在pH=11.0的条件下，结构恢复后的胶原分散体系的黏度又有所升高，这主要归因于在强碱性体系中，胶原表面的净负电荷大量增加，从而形成比较强的排斥力，造成胶原纤维之间各类次级键断裂，二级结构和三级结构也因此遭到毁坏，使得胶原纤维由规则的聚集体转变为松散的无规状态，使得胶原分散体系黏度上升[9]。

盐酸胍浓度为0.25 mol/L时，不同pH条件下胶原体系触变性的测定结果如图4所示。图4结果显示，在体系结构的恢复过程中，4种pH不同的盐酸胍/胶原分散体系的|η*|随t均上升，最终趋于平缓，表现为正触变性特征。

图4 pH对0.25 mol/L的盐酸胍/胶原分散体系触变性的影响

盐酸胍作为一种典型的氢键破坏剂，可以使胶原分子的构象和聚集态结构发生变化。当含量较低时（c=0.25 mol/L），盐酸胍只能削弱胶原分子之间的相互作用力，但无法使胶原变性[10]，胶原体系的结构仍以网络结构为主，所以体系的复合黏度|η*|随t均上升，呈现出正触变性特征。

当pH值为7.2、9.0和11.0时，|η*|随t先急剧升高，后趋于平缓，说明与酸性条件（pH=5.0）相比，中性和碱性条件更有利于胶原体系的恢复过程。

盐酸胍浓度为1.0 mol/L时，在不同pH条件下测定的胶原体系的触变性结果如图5所示。由图5可以看出，当pH为7.2时，体系的|η*|在前250 s内迅速升高，达到最大值后又明显降低，表现为复合触变性；而当pH为5.0、9.0和11.0时，体系的|η*|随t降低，表现为负触变性。

图5 pH对1.0 mol/L的盐酸胍/胶原分散体系触变性的影响

在中性条件下，当浓度增大到1.0 mol/L时，盐酸胍可以使少量胶原分子发生变性，在一定程度上破坏了胶原体系的网络结构；高速预剪切时，较高的外加剪切力进一步破坏了体系的网络结构，形成了一些尺寸较大的聚集体。而在结构恢复过程中的前250 s内，这些尺寸较大的聚集体之间可以相互聚集，从而使体系的黏度升高；但随着测定时间的延长，盐酸胍可以二次破坏胶原分子内和分子间的氢键，使体系的黏度随时间再次降低，整个结构的恢复过程总体表现为复合触变性特征。而当胶原体系的酸性或碱性增加时（pH为5.0、9.0和11.0），使得聚集体之间的相互排斥作用增强，不易相互靠近形成网络结构，因此体系粘度随时间降低，表现出负触变性。

盐酸胍浓度增大至2.0 mol/L时，不同pH条件下胶原体系触变性的测定结果如图6所示。可以看出，当预剪切停止后，在4种pH值条件下，体系的复合黏度随时间的延长迅速降低，约200 s后趋于平缓，呈现出负触变性特征。

图6 pH对2.0 mol/L的盐酸胍/胶原分散体系触变性的影响

当浓度较高时，盐酸胍对胶原的变性作用更为显著，能够使胶原分子解聚集，甚至破坏胶原分子的三螺旋结构，使多肽链发生解离[11]。在结构的恢复过程中，解离出的肽链发生卷缩，致使体系的黏度进一步降低，表现出负触变性特征。而酸性及碱性条件加剧了盐酸胍对胶原的解聚集作用，使体系结构恢复平衡时的粘度值远低于中性胶原体系。

3 结论

盐酸胍作为一种典型的氢键破坏剂，可以使胶原发生构象和聚集态结构的变化，而pH值可以影响这种变化过程。当浓度增加至1.0 mol/L时，盐酸胍可以使少量胶原分子发生变性，体系在中性条件下表现为复合触变性，而在酸性或碱性条件下表现出负触变性。而当盐酸胍浓度增加至2.0 mol/L时，盐酸胍可以诱导胶原分子解聚集直至解螺旋，使得胶原体系在所研究的pH范围内，皆表现为负触变性，酸性及碱性条件能够加剧盐酸胍对胶原的解聚集作用，使结构恢复平衡时体系的黏度值远低于中性胶原体系。