南丰蜜橘中产醋酸菌的分离及其生长特性

朱艺恒，潘红菊，汪涯

（1.江西师范大学附属中学，江西南昌330046；2江西科技师范大学生物加工过程重点实验室，江西南昌330013）

南丰蜜橘是江西的名优特产，因其果香浓郁、汁多味美、香甜可口、营养丰富而备受人们喜爱。蜜橘鲜果多在每年的11月、12月集中上市，且皮薄柔嫩，不耐运输和仓储，极易腐败变质，造成严重的经济损失[1]。笔者前期在江西南丰县的蜜橘果园采风时发现，腐败的蜜橘会散发出一种独特蜜橘风味的酸味，极有可能是某类产酸（醋酸）的微生物发酵所致。试想，如能开发利用这些产酸微生物，将其运用在产酸的蜜橘发酵饮料等果蔬深加工领域，不仅能促进我国的蜜橘等果蔬加工利用水平，而且对于解决农民增产不增收问题，增强农户种植蜜橘积极性，都具有重要的经济和社会效益。鉴于此，本研究拟对江西南丰蜜橘果园内自然衰老腐败后略带酸性气味的蜜橘进行采集，对其中产醋酸的菌株进行初步的分离纯化，并对其生长特性进行初步研究，以期筛选获得南丰蜜橘中优良的产醋酸菌株资源，为发酵性蜜橘果饮的开发提供菌种支持。

1 材料与方法

1.1 样品采集

供试南丰蜜橘于2017年11月采集自江西省南丰县南丰蜜橘果园，选取无明显病灶自然衰老腐败且散发酸性气味的蜜橘，置于冰袋中带回实验室24 h内完成菌种分离。

1.2 仪器设备

超净工作台（苏州安泰）、生化培养箱（天津市泰斯特）、恒温培养振荡箱（上海智城）、灭菌锅（新华医药）、电子天平（梅特勒）、紫外/分光光度计（Lambda 365 UV-VIS，上海佑科）、生物显微镜（尼康）、电泳仪（北京市六一仪器厂）、高速冷冻离心机（湖南湘仪）、PCR扩增仪（伯乐）、凝胶图像分析系统（美国西盟）。

1.3 培养基

菌株富集培养基配方为：10 g/L酵母膏、10 g/L葡萄糖、5mg/L制霉菌素、4%无水乙醇；菌株分离和保藏培养基配方为：15 g/L CaCO3、10 g/L酵母膏、10 g/L葡萄糖、1.8%琼脂粉、4%无水乙醇；基础发酵培养基为：10 g/L酵母膏、10 g/L葡萄糖、4%无水乙醇，所有培养基的pH均为自然。

1.4 菌株分离纯化

将采集的蜜橘样品用无菌水清洗3～5次，用75%酒精擦拭表面30～60 s，去皮后放入无菌的碾钵内碾磨，取10 mL汁液接入含50 mL富集培养基的250 mL摇瓶中，置于32℃、150 r/min的摇床种富集培养48 h。取富集培养液进行对倍梯度稀释，将10-3和10-5的样品稀释液接入分离平板进行涂布培养，32℃恒温培养72 h。挑取能再分离平板上生长且有透明圈的菌株进行纯化培养3代，4 ℃试管斜面保藏，用于后续定性筛选。

1.5 菌株定性筛选及形态特征

参考苏龙等[2]的方法进行产醋酸的定性分析。将上述分离获得的菌株进行液态发酵培养，离心取上清液1 mL加入19 mL无菌水混匀后，用0.05 mol/LNaOH调pH至7.0，加入50 g/L FeCl3溶液4～6滴混匀，如形成黄褐色沉淀，且加热至沸腾仍出现红褐色沉淀，则供试菌种为产醋酸菌株。将定性筛选确定为产醋酸的菌株接种在发酵培养基上，对其菌落形态进行观测；采用革兰氏染色法，对菌株的显微形态进行观察。

1.6 菌株16S rDNA序列系统发育分析

采用细菌DNA提取试剂盒并按其操作说明提取产醋酸菌株的总DNA。电泳检测后选用细菌16S rDNA的通用引物27F（5’-AGAGTTTGA TCMTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACGGYTACCTTGT TACGACTT-3’）对菌株的16S rDNA序列进行PCR扩增。PCR扩增体系为20 μL PCD Mix，正向和反向引物各2 μL，1μL模板DNA及15 μLddH2O；反应程序为：95 ℃变性2min，95 ℃复性30s，55 ℃延伸30s，72 ℃退火90s，共30个循环，72 ℃再延伸5min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物条带后送上海生工进行测序。将所得序列提交NCBI数据进行Blast比对分析，选取并下载与供试菌株序列最为相近的菌株序列，利用MEGA 7构建其系统发育进化树，对菌株进行分子鉴定。

1.7 菌株生长和产醋酸特性

将菌株接入发酵培养基后，至于32 ℃、150r/min的摇床中培养7～10 d，期间每日测定菌株的生长情况，以OD600的数值指示菌体浓度。菌株产醋酸的定量测定参考涂佳等[3]的方法。取发酵液进行适当稀释，滴加0.5%酚酞为指示剂，用0.05 mol/L NaOH溶液滴定至终点（浅粉色），记录NaOH的用量并换算为醋酸的含量，其中对照组为空白培养基滴定。

2 结果与分析

2.1 菌株分离筛选

共计从自然腐败带酸性气味的南丰蜜橘样品中分离获得3株细菌，选取梯度稀释至10-4的富集培养液样品涂布平板分离效果最好，生长出来的单个菌落能均匀分布在分离平板上（图1A），且添加的制霉菌素也能较好地抑制霉菌等的污染。挑取不同菌落形态的菌株进行3～5代纯化后，生长在发酵培养基中的菌落形态如表1所示，菌落表面均湿润光滑，易挑取，编号为NF-1、NF-2和NF-3的菌株的颜色有一些差异，将菌株分别保藏后进行产醋酸定性分析。

2.2 产醋酸菌株的定性分析及形态特征

图1 南丰蜜橘中产醋酸菌的分离筛选及菌株NF-1形态特征图谱

表1 南丰蜜橘中产醋酸菌的分离筛选结果

通过产醋酸显色沉淀实验进行定性验证分析发现，编号为NF-2和NF-3菌株不能在分离平板中形成透明溶解CaCO3的晕圈，且在FeCl3溶液里没有颜色变化和沉淀产生，表明它们不能产醋酸。菌株NF-1既可在分离平板中形成透明的晕圈（图1B），也能在FeCl3溶液里形成稳定的红褐色沉淀（图1C），表明其可代谢产生醋酸。菌落形态观察结果显示，菌株NF-1菌落圆形，颜色灰白色，表面湿润，易挑取，菌落质地均一、光滑，革兰氏染色实验结果显示其为革兰氏阴性菌株（图1D）。

2.3 菌株NF-1的分子鉴定

采用通用引物进行PCR扩增其16S rDNA序列后电泳检测有清晰的条带，表明PCR扩增成功，便送往上海生工公司测序。将测序后的序列提交NCBI数据进行Blast比对分析，结果显示，菌株NF-1与数据库中的葡糖醋杆菌Gluconacetobacter sp. SC-01相似度最高，可达99%。进一步下载数据库中比对最为接近的不同种类的菌株序列，基于NF-1菌株的16S rDNA序列构建其系统发育分析，结果显示，菌株NF-1与葡糖醋杆菌属Gluconacetobacter的菌株进化关系较近，可与Gluconacetobacter sp. SC-01聚类在一枝，综合以上分析，将菌株NF-1鉴定为葡糖醋杆菌Gluconacetobacter，暂命名为Gluconacetobactersp. NF-1。

图2 基于细菌16S rDNA序列构建系统进化发育分析图谱

2.4 菌株NF-1摇瓶发酵产醋酸

采用比浊法对菌株在发酵培养基中的生长曲线进行研究，实验结果见图3。结果显示，菌株NF-1生长快速，在发酵培养基中培养约2 d时菌体生长达到相对稳定阶段，进入稳定期，OD600数值也趋于平缓。但随后菌株的生长没有明显的增加，直到发酵6 d后，菌株的生长再次呈现增长趋势，推测其原因可能是发酵过程中产生的醋酸对菌株的生长造成了影响，经过醋酸的不断诱导后，菌株适应了含有醋酸的环境，表现为继续增长的趋势。发酵过程中醋酸的产量曲线显示，发酵5 d后醋酸的产量最高，可达（31.65±1.48）g/L。菌株NF-1代谢积累醋酸的含量与菌株细胞本身的不断生长趋势是一致的，即醋酸的积累与菌株细胞的生长是生长相关型。

图3 菌株NF-1摇瓶发酵生长及产酸图谱

3 结论

开展果蔬发酵功能菌株的自然选育和菌种资源库的建立工作，对提升我国的果蔬深加工水平具有重要意义。本文报道了从自然腐败的南丰蜜橘中分离纯化产醋酸的菌株，通过平板分离初筛和产醋酸的定性分析，结果从分离获得的3株细菌中筛选得到1株可代谢产醋酸的菌株NF-1。结合细胞形态和16S rDNA序列系统发育分析的结果，将其鉴定为葡糖醋杆菌属，暂命名为Gluconacetobactersp. NF-1。摇瓶发酵的结果显示，其细胞的生长和发酵产醋酸的过程为生长相关型，其在发酵6 d后醋酸的产量可达（31.65±1.48）g/L。本研究不但为后续优化菌株NF-1高产醋酸发酵工艺奠定了基础，还可以为开发南丰蜜橘中优良的产醋酸菌种资源和研制新型发酵性蜜橘果饮提供参考。