补体C3在2型糖尿病及正常大鼠脂肪干细胞中甲基化差异研究

王蕾 陈旭涛 丁锋 刘向东 宋应亮

2型糖尿病(T2DM)是一种先天性免疫和低度慢性炎症性疾病，患者体内高脂高糖环境，高炎症状态等，对牙周治疗及种植修复都会产生较大影响[1]。补体系统作为调节体内免疫和炎症平衡系统，与糖尿病的发生相关联，补体C3作为启动补体活化旁路途径并参与级联反应的重要分子，是预测2型糖尿病的危险因素[2]，其表达水平与胰岛素抵抗正相关。T2DM 同正常个体来源的细胞在遗传学信息，即基因本身方面并没有不同，什么原因影响了C3的表达呢？本研究通过比较2型糖尿病及健康大鼠来源的脂肪干细胞(ASCs)中C3基因的DNA甲基化水平，探索2型糖尿病机体环境影响ASCs中C3表达的机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

MEM α培养基(HyClone，美国)；胎牛血清(四季青，浙江天杭)；总RNA提取试剂盒(北京天根); 总DNA提取试剂盒、 反转录试剂盒、RT-PCR试剂盒(Takara，日本)； 琼脂糖(Sigma, 美国)； PCR清洁回收试剂盒(Axygen， 美国)； EZ DNA Methylation-GoldTM Kit(Zymo， 美国)； VAHTS Turbo DNA Library Prep Kit (Vazyme, 美国)； High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche, 瑞士)； GeneJET GelExtraction Kit、 CO2孵箱(Thermo，美国)； 倒置显微镜(OLYMPUS，日本)。

1.2 ASCs的分离及培养

选取2型糖尿病及正常大鼠，过量麻药处死。75%酒精浸泡15 min, 无菌条件下取腹股沟处的脂肪组织， 剪碎呈乳糜状， 0.2%的Ⅰ型胶原酶消化50 min, 过滤取滤液，离心重悬，接种于培养瓶，37 ℃、 5% CO2细胞孵箱培养。换液3 d/次，细胞汇合至80%时传代。

1.3 干细胞的表面标志物鉴定

取第1 代(P1)的ASCs-T2DM及ASCs-control(C)细胞，胰酶消化离心，完全培养基重悬。将细胞悬液分装至1.5 ml离心管内，控制细胞数量，使每管细胞数1×106， 加入抗体CD29, CD90, CD34, CD45， 进行流式检测。

1.4 ASCs多向分化能力检测

成脂分化：选P1的ASCs-T2DM及ASCs-C细胞，以2.5×105的密度接种于六孔板内，待细胞汇合至80%～90%时，更换成脂诱导液。 14 d天后，多聚甲醛固定,油红O染色,显微镜下观察并拍照。

成骨分化：选P1的ASCs-T2DM及ASCs-C细胞，以2.5×105的密度接种于六孔板内，待细胞汇合至80%～90%时，更换成骨诱导液。诱导28 d后，多聚甲醛固定。0.1%茜素红染液室温避光孵育2～3 min，镜下观察拍照。

1.5 DNA的提取及全基因组甲基化检测

选取P1 ASCs-T2DM及ASCs-C细胞，用总DNA提取试剂盒进行DNA提取，提取纯度达1.7～2.1，做全基因组甲基化测序。

1.6 q-PCR检测C3表达

提取P1 ASCs-T2DM及ASCs-C细胞总RNA,反转录，qPCR检测C3基因的表达。具体操作步骤参考试剂盒说明书，引物由北京奥科生物合成(表1)。

1.7 PCR检测C3启动子区特定区域甲基化

表1 qPCR引物序列

选P1 ASCs-T2DM及ASCs-C细胞，用总DNA提取试剂盒进行DNA提取，重亚硫酸氢盐转化，PCR扩增，PCR产物割胶纯化，送测序。

1.8 统计学分析

用SPSS 17.0软件进行统计分析， 2 组比较采用成组t检验， 检验水准为P<0.05。

2 结 果

2.1 细胞形态观察

原代培养第3 天， 可见细胞逐渐贴壁， 7 d后， 细胞生长融合至80%; 传代培养后可见P1细胞多为长梭形，多角形或星形; 不同大鼠个体来源的ASCs形态无明显差异(图1)。

2.2 干细胞的表面标志物鉴定

ASCs-T2DM及ASCs-C细胞，均阳性表达干细胞相关的标志物(CD29和CD90)，不表达血细胞相关的标志物(CD34和CD45)(图2)。 2 种干细胞相关分子表达水平上均无明显的统计学差异(P>0.05)(图2)。

2.3 多向分化能力检测

ASCs-T2DM及ASCs-C细胞经诱导均可成脂分化，产生串珠样脂滴(图3)。经成骨诱导并染色后，发现2 组细胞均可形成矿化结节(图3)。

2.4 全基因组甲基化检测

甲基化实验结果如图4显示：基因启动子区甲基化差异的基因共有253 个， 其中C3基因启动子区甲基化水平改变显著。GO分析中，C3基因启动子区甲基化差异与免疫及炎症调控， 细胞因子分泌，血管生成等显著相关。IGV可视化软件分析：ASC-T2DM中C3基因启动子甲基化水平低于样本ASC-C，启动子区甲基化主要发生在chr9: 9720616-9721188区域。

图1 ASCs-C及ASCs-T2DM形态学观察 (倒置显微镜，×40)

Fig 1 The morphology of ASCs-C and ASCs-T2DM (Inverted microscope, ×40)

2.5 C3表达对比

q-PCR结果如图5显示：C3基因在ASCs-T2DM中的表达高于ASCs-C, 统计分析显示两种细胞C3基因表达有统计学差异(P<0.001)。

2.6 C3启动子区特定片段的甲基化对比

2.6.1 PCR电泳 PCR结果(图6)及测序结果(图7)显示：来源于ASCs-T2DM的样本中，C3基因启动子特定区域甲基化水平低ASCs-C样本， 两者具有显著差异(P<0.05)。

2.6.2 甲基化差异树状聚类图 对两样本C3基因启动子特定区域甲基化差异进行聚类分析,结果如图8显示：ASCs-T2DM样本来源的C3基因启动子特定区域甲基化水平处于0～0.5，明显低于ASCs-C样本。

图2 细胞细胞表面标志物检测

3 讨 论

近年来研究表明应用干细胞可以提升糖尿病患者种植体骨结合[3-4]。相比异体干细胞，自体干细胞具有更好的免疫抑制和长期的移植生存[5]。但来源于糖尿病个体的ASCs再生性能弱于健康个体来源， 其机体环境对干细胞的性能产生较大影响[6]。

DNA甲基化是表观遗传的一种，是连接基因表达和环境的重要纽带，具体是指在DNA甲基转移酶的催化下，将甲基加在胞嘧啶的5-碳端，从而形成5甲基胞嘧啶[7]。DNA甲基化可出现在整个基因区域，但不同区域对基因表达的影响不同。而出现在基因启动子区的DNA甲基化，一般会抑制基因的表达[8]。

研究发现,DNA甲基化的改变对于糖尿病等代谢性疾病具有重要意义，糖尿病环境可引起DNA总体甲基化水平的改变[9]。而特定与糖尿病相关基因的甲基化检测结果显示，糖尿病机体环境与特定基因甲基化密切相关[10]。除此之外，DNA甲基化与干细胞分化的关系也被广泛研究[11-12]。

脂肪组织在免疫调节，炎症控制，骨量维持等方面，具有重要作用[13]。来源于脂肪组织的ASCs，分泌多种促血管生成和抗凋亡因子， 发挥抗炎、 抗氧化的作用。但是糖尿病个体来源的脂肪组织，其分泌的细胞因子显著改变[14]。同时，糖尿病大鼠来源的ASCs相比正常大鼠ASCs,其增殖分化、促进细胞更新和自发修复、免疫调节能力显著下降[15]。为探究糖尿病机体环境对ASCs基因表达的影响，我们引入表观遗传的重要部分-DNA甲基化，选取来自T2DM及正常大鼠的ASCs,探究DNA甲基化在两者中的差异。

全基因组甲基化测序结果显示， 基因启动子区甲基化差异基因共有253个，其中C3基因启动子区甲基化差异较为显著。GO分析表明，C3甲基化差异与免疫功能调节，炎症因子分泌，血管生成显著相关。为了验证甲基化水平与基因表达的负性调控关系，我们进一步在转录水平检测2 组细胞C3的表达，结果显示，糖尿病大鼠来源的ASCs中C3基因表达量显著高于正常大鼠来源的ASCs，而其启动子区甲基化水平低于ASCs-C样本，此结果进一步证实DNA甲基化水平确实影响C3基因的表达。但是2型糖尿病机体环境是否一定能引起C3基因启动子区甲基化水平稳定的改变？后期试验中直接选取在全基因组测序结果检测得到的C3启动子区甲基化水平改变片段，重新提取糖尿病及正常大鼠ASCs DNA，进行特定片段的甲基化水平检测， 证实在此片段出现甲基化水平差异。充分说明，糖尿病机体环境降低了C3基因启动子区特定片段甲基化水平，进而使C3基因表达水平增加。

图3 油红O和茜素红染色 (倒置显微镜，×100)

Fig 3 Oil red and alizarin red staining (Inverted microscope, ×100)

图4 ASCs-C及ASCs-T2DM中C3启动子区甲基化差异(IGV可视化对比)

Fig 4 Methylation difference in C3 promoter region in ASCs-C and ASCs-T2DM (IGV visual contrast)

图5 C3基因的表达 图6 C3基因甲基化PCR电泳结果 图7 C3基因启动子测定区域甲基化箱线图

Fig 5 C3 genes expression Fig 6 PCR results of methylated C3 Fig 7 Methylation boxplot of C3 gene promoter area

补体C3可参与脂质代谢，同时其作为补体系统重要一员，调节体内免疫和炎症的平衡，并与胰岛素抵抗及糖尿病的发生相关联。一方面，单纯糖尿病会导致C3水平升高，进而引发糖尿病患者的高炎症状态[16]。另一方面C3及活化产物可沉积在糖尿病患者血管内，形成循环免疫复合物，导致2型糖尿病血管病的产生[17]。对于口腔种植而言，糖尿病的机体高炎症以免疫缺陷状态影响患者口腔健康状态和种植治疗，而其血管功能障碍会进一步阻碍种植体骨结合。

脂肪来源的ASCs是具有再生功能的干细胞，不仅可以进行免疫调节， 细胞因子分泌等[18]， 近些年来在骨再生等组织再生方面有重要应用。但来源于T2DM的自体ASCs在增殖及分化，及相关基因表达上与ASCs-C显著不同，而机体环境是引起此种差异的重要原因[15]。为了探究环境对于基因表达影响的机制，我们引入表观遗传-DNA甲基化的概念，通过全基因组测序结合基因表达分析，验证了前期实验假说，并通过二次特定序列甲基化测序，进一步确定DNA甲基化在特定片段发生稳定的改变。实验结果为进一步探究并提升自体ASCs的应用奠定了基础，以期后期应用基因编辑技术特异性改造DNA甲基化改变片段，改善自体干细胞的再生性能，获得更佳的应用效果。

图8 C3基因启动子测定区域甲基化水平树状聚类图(横坐标：CG位点；每个样本为一行；位点甲基化水平用不同灰度方块代表)

Fig 8 Methylation dendrogram of C3 gene promoter area(Abscissa: CG locus; Each sample is a row; Site methylation level represented by squares of different grayscale)