虎杖苷对肺癌A549细胞增殖和侵袭的抑制作用及机制探讨

孙蓓，叶因涛

肺癌是世界上最常见的原发性恶性肿瘤［1］。尽管临床治疗技术不断发展，但其治疗效果仍不理想。传统的化疗药物存在毒性大、容易产生耐药性等不足，因此从天然产物中寻找抗癌药物已成为肿瘤研究的热点。虎杖苷（polydatin，PD）是虎杖根中提取的天然化合物，常被用于治疗慢性支气管炎等疾病［2］。近年来，虎杖苷被发现对乳腺癌等肿瘤具有一定的体外抑制效果［3］，但是其对肺癌的抑制作用尚鲜见报道。本研究观察了虎杖苷对人肺癌A549细胞增殖和侵袭能力的影响，并初步探索其分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料及试剂 肺癌A549细胞购自中国科学院上海生命科学研究院。虎杖苷、青霉素和链霉素购自美国Sigma-Aldrich 公司，胎牛血清（FBS）和DMEM 培养基购自美国Corning 公司，Transwell 细胞侵袭试剂盒购自美国Coster 公司，酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自美国R&D Systems生物技术公司，Western blot 相关抗体购自美国Cell Signaling公司，Lipofectamine 2000和TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司，cDNA 合成试剂盒购自大连TaKaRa 公司，ECL 试剂盒购自美国Millipore公司，核因子（NF）-κB报告基因试剂盒购自美国Promega公司。

1.2 细胞培养 肺癌A549 细胞在37 ℃、5%CO2条件下，在含有10% FBS、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 g/L）的DMEM 培养基中进行培养。细胞通过0.25%胰蛋白酶-EDTA消化以进行传代。所有实验均使用对数生长期的细胞。

1.3 四氮唑盐实验（MTS）检测虎杖苷对A549细胞增殖的影响 将处于对数生长期的A549细胞（5×104个细胞/mL）接种在96孔微量培养板中（每孔100µL），培养过夜，加入不同浓度的虎杖苷（0、10、20、50、100、200 mg/L）后继续培养24、48和72 h后，更换新鲜培养基100µL，加入20µL MTS（5 g/L），继续培养4 h 后，用酶标仪测量490 nm 波长处光密度（OD）值，表示细胞生长情况。药物对这些细胞的抑制率计算如下：抑制率=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。

1.4 Transwell实验检测虎杖苷对A549细胞侵袭的影响 将处于对数生长期的A549 细胞（2.5×105个细胞/mL）接种在预铺有Matrigel 胶的24孔侵袭小室上层（每孔100µL），并加入10 mg/L和20 mg/L虎杖苷处理48 h，小室下层加入500µL完全培养基。4%多聚甲醛室温固定10 min。经HE染色后，通过显微镜观察细胞侵袭数，计算细胞侵袭率。收集小室上层的培养液用于后续细胞因子分泌检测。

1.5 ELISA检测虎杖苷对A549细胞因子分泌的影响 将侵袭实验中收集的培养基通过ELISA检测细胞转化生长因子β（TGF-β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达水平，具体实验步骤见试剂盒说明书。通过标准曲线计算TGF-β 和TNF-α含量。

1.6 Western blot 检测虎杖苷对A549 细胞肿瘤相关基因蛋白表达的影响 将处于对数生长期的A549 细胞（3×106个/mL）接种在6 孔培养板中（每孔100µL），培养过夜，0、10、20 mg/L虎杖苷处理48 h后，收集细胞，提取蛋白质，随后将其在12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离并转移到PVDF膜上。然后，将膜与抗基质金属蛋白酶（MMP）-2抗体（1∶1 500）、抗MMP-9 抗体（1∶1 500）、抗整合素（integrin β4）抗体（1∶1 500）、抗Toll 样受体3（TLR3）抗体（1∶1 500）、抗CD44 抗体（1∶1 500）、抗丝氨酸/苏氨酸激酶（AKT）抗体（1∶1 500）、抗p-AKT 抗体（1∶1 000）在4 ℃条件下孵育过夜，βactin（1∶5 000）作为内参。次日洗去表面未结合的抗体后，加入辣根过氧化酶标记的二抗再孵育1 h，用ECL试剂盒显影，计算相对表达量。

1.7 Real-time PCR 检测虎杖苷对A549 细胞肿瘤相关基因mRNA 表达的影响 将处于对数生长期的A549 细胞（3×106个/mL）接种在6 孔培养板中（每孔100µL），培养过夜，用0、10、20 mg/L虎杖苷对细胞处理48 h后，使用TRIzol 试剂从组织样品中提取RNA。使用cDNA合成试剂盒合成cDNA。使用SYBR Green PCR Master Mix 试剂盒检测肿瘤相关基因mRNA 的相对表达水平，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参。反应程序：95 ℃10 min；94 ℃65 s、60 ℃30 s、72 ℃35 s，共进行40 个循环，以2-ΔΔCt法计算相对表达量。PCR 引物序列见表1。

Tab.1 PCR primer sequence表1 PCR引物序列

1.8 报告基因系统检测虎杖苷对A549 细胞NF-κB 启动子活性的影响 将处于对数生长期的A549细胞（3×106个/mL）接种在6 孔培养板中（每孔100 µL），培养过夜，以Lipofectamine 2000转染NF-κB荧光素酶报告基因质粒，继续培养6 h后，加入虎杖苷对细胞处理48 h，以荧光素酶报告基因系统检测NF-κB启动子活性。

1.9 统计学方法 采用SPSS 11.0软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差（）表示，通过GraphPad 5.0软件计算半数抑制浓度（IC50）。细胞增殖抑制率均数比较采用析因设计的两因素方差分析，其他研究均数比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间多重比较采用LSD-t法检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 虎杖苷对A549 细胞增殖的抑制作用 MTS 结果显示，虎杖苷以剂量依赖（F=403.128，P＜0.05）和时间依赖（F=709.506，P＜0.05）的方式抑制A549 细胞体外增殖，两者具有显著交互作用(F=44.900，P＜0.05)，IC50（24 h）为172.23 mg/L，IC50（48 h）为75.15 mg/L，IC50（72 h）为34.89 mg/L，见表2。为了观察虎杖苷对A549细胞体外侵袭能力的影响和机制，选取无毒浓度10 mg/L（抑制率＜5%）和低毒浓度20 mg/L（抑制率＜15%）以及抑制率适中的作用时间（48 h）进行后续实验，避免细胞增殖抑制对结果的影响并体现剂量和时间依赖性。

Tab.2 The inhibitory effect of polydatin on proliferation of lung cancer A549 cells表2 虎杖苷对人肺癌A549细胞增殖的抑制作用（n=5，%，）

Tab.2 The inhibitory effect of polydatin on proliferation of lung cancer A549 cells表2 虎杖苷对人肺癌A549细胞增殖的抑制作用（n=5，%，）

a与10 mg/L 组比较，b与20 mg/L 组比较，c与50 mg/L 组比较，d与100 mg/L组比较，P＜0.05

组别10 mg/L组20 mg/L组50 mg/L组100 mg/L组200 mg/L组增殖抑制率24 h 2.3±0.5 4.1±0.5a 9.8±0.9ab 24.5±2.2abc 57.9±5.4abcd 48 h 4.4±0.4 9.8±0.8a 27.3±3.1ab 62.6±7.1abc 99.5±8.5abcd 72 h 10.3±0.9 23.7±1.4a 63.6±5.4ab 97.6±8.9abc 99.6±8.9abc

2.2 虎杖苷对人肺癌A549 细胞侵袭的抑制作用 与0 mg/L 比较，10 mg/L 和20 mg/L 虎杖苷处理48 h 后，A549 细胞体外侵袭能力显著下降［侵袭细胞数（个）：63.3±15.0、41.7±11.5、22.0±5.0，n=3，F=10.047，均P＜0.05］，见图1。

2.3 虎杖苷对人肺癌A549细胞侵袭相关基因的调控作用 Western blot 和Real-time PCR 结果显示，10 mg/L和20 mg/L虎杖苷处理48 h后，A549细胞中MMP-2/9、integrin β4、TLR3 和CD44 蛋白和mRNA表达显著下调（P＜0.05），见表3、4，图2。

2.4 虎杖苷对人肺癌A549细胞炎性因子表达的调控作用 10 mg/L 和20 mg/L 虎杖苷处理48 h 后，培养基中TGF-β 和TNF-α 含量显著下调，TLR3 mRNA及蛋白表达显著下调（P＜0.05），见表5、图3。

Fig.1 The inhibitory effect of polydatin on invasion of lung cancer A549 cells(HE staining,×200)图1 虎杖苷对人肺癌A549细胞侵袭的抑制作用（HE染色，×200）

Tab.3 Polydatin regulated the protein expression of invasion related proteins of lung cancer A549 cells表3 虎杖苷对人肺癌A549细胞侵袭相关的蛋白表达的调控作用（n=5，）

Tab.3 Polydatin regulated the protein expression of invasion related proteins of lung cancer A549 cells表3 虎杖苷对人肺癌A549细胞侵袭相关的蛋白表达的调控作用（n=5，）

＊＊P＜0.01；a 与0 mg/L 组比较，b 与10 mg/L 组比较，P＜0.05；表4～6同

组别MMP-2MMP-9integrin β4CD44 1.000±0.102 0.754±0.082a 0.201±0.018ab 143.940＊＊0 mg/L 10 mg/L 20 mg/L F 1.000±0.095 0.658±0.061a 0.218±0.022ab 174.240＊＊1.000±0.085 0.678±0.057a 0.252±0.021ab 193.485＊＊1.000±0.087 0.576±0.055a 0.182±0.016ab 231.352＊＊

Tab.4 Polydatin regulated the mRNA expression of invasion related genes of lung cancer A549 cells表4 虎杖苷对人肺癌A549细胞侵袭相关基因mRNA表达的调控作用（n=5，）

Tab.4 Polydatin regulated the mRNA expression of invasion related genes of lung cancer A549 cells表4 虎杖苷对人肺癌A549细胞侵袭相关基因mRNA表达的调控作用（n=5，）

组别0 mg/L 10 mg/L 20 mg/L F MMP-2 1.000±0.055 0.663±0.047a 0.437±0.035ab 186.391＊＊MMP-9 1.000±0.082 0.574±0.042a 0.418±0.030ab 145.030＊＊integrin β4 1.000±0.067 0.417±0.027a 0.288±0.015ab 396.692＊＊CD44 1.000±0.077 0.518±0.044a 0.382±0.031ab 179.232＊＊

Fig.2 Polydatin regulated the expression of invasion related proteins of lung cancer A549 cells图2 虎杖苷对人肺癌A549细胞侵袭相关的蛋白表达的调控作用

Tab.5 The influence of polydatin in the content of inflammatory factor and related gene in lung cancer A549 cells表5 虎杖苷对人肺癌A549细胞炎性因子和相关基因表达的影响（n=5，）

Tab.5 The influence of polydatin in the content of inflammatory factor and related gene in lung cancer A549 cells表5 虎杖苷对人肺癌A549细胞炎性因子和相关基因表达的影响（n=5，）

组别0 mg/L 10 mg/L 20 mg/L F TGF-β（ng/L）72.31±8.20 57.53±6.49a 36.82±3.85ab 38.391＊＊TNF-α（ng/L）463.43±24.71 341.52±21.17a 261.90±15.37ab 119.326＊＊TLR3 mRNA 1.000±0.078 0.575±0.064a 0.368±0.041ab 131.285＊＊蛋白1.000±0.094 0.821±0.075a 0.376±0.032ab 100.000＊＊

2.5 虎杖苷对人肺癌A549细胞AKT/NF-κB信号通路的调控作用 结果显示，10 mg/L 和20 mg/L 虎杖苷处理48 h 后，A549 细胞中p-AKT 表达（AKT 磷酸化水平）显著下调，见图4、表6。报告基因实验结果显示，10 mg/L 和20 mg/L 组NF-κB启动子相对活性显著下调，见表6。

Fig.3 Polydatin regulated the protein expression of TLR3 of lung cancer A549 cells图3 虎杖苷对人肺癌A549细胞TLR3蛋白表达的调控作用

Fig.4 Polydatin regulated the phosphorylation of AKT of lung cancer A549 cells图4 虎杖苷对人肺癌A549细胞AKT磷酸化的调控作用

Tab.6 The influence of polydatin in the activity of AKT/NF-κB signal pathway in lung cancer A549 cells表6 虎杖苷对人肺癌A549细胞AKT/NF-κB信号通路的影响（n=5，）

Tab.6 The influence of polydatin in the activity of AKT/NF-κB signal pathway in lung cancer A549 cells表6 虎杖苷对人肺癌A549细胞AKT/NF-κB信号通路的影响（n=5，）

组别0 mg/L 10 mg/L 20 mg/L F p-AKT相对表达量1.000±0.084 0.687±0.051a 0.106±0.011ab 315.741＊＊NF-κB启动子相对活性1.000±0.080 0.752±0.069a 0.553±0.059ab 51.383＊＊

3 讨论

3.1 虎杖苷对肺癌细胞体外增殖和侵袭的抑制作用 肺癌是一种常见的、死亡率高的恶性肿瘤。肺癌患者的不良预后与肿瘤细胞增殖和侵袭密切相关。在本研究中，笔者观察到虎杖苷抑制细胞增殖并抑制细胞侵袭。这些结果表明，虎杖苷是具有抗肺癌作用的天然化合物。

3.2 虎杖苷对肺癌细胞肿瘤相关基因表达的调控作用 肺癌转移涉及到多个基因和信号通路的改变等，研究虎杖苷干预肺癌发生、发展中关键性的调控基因是临床前应用基础研究的重要内容。基质金属蛋白酶是重要的促肿瘤侵袭基因，可通过侵蚀细胞外基质造成肿瘤的侵袭和远端转移［4］。MMP-2/9是重要的基质金属蛋白酶［5-6］。本研究发现虎杖苷可抑制A549细胞MMP-2/9蛋白和mRNA水平。CD44是重要的异质性黏附分子，也是重要的促肿瘤侵袭基因［7-8］。本研究也发现虎杖苷可抑制A549 细胞CD44 蛋白和mRNA 水平。整合素是由α 和β 亚基组成的多亚基蛋白，其中β1 和β4 亚型与肿瘤转移有关，而其过度表达与肿瘤进展和转移密切相关。整合素β4（integrin β4）可以激活局部黏着斑激酶以进一步释放β-连环蛋白，后者可以迁移到细胞核中调节肿瘤生长和侵袭相关蛋白（如MMP-2/9 和CD44）的表达［9-11］。在本研究中，虎杖苷可能通过抑制integrin β4表达，进而下调MMP-2/9和CD44的表达，抑制肺癌细胞的增殖和侵袭。

炎症因子在肺癌转移过程中具有重要作用，在肺癌上皮细胞中激活TLR3，可以通过诱导肿瘤相关炎症因子表达促进肺癌转移。本研究发现，虎杖苷可以显著抑制肿瘤细胞TGF-β和TNF-α表达，下调TLR3表达，这可能是抑制上述炎症因子表达的机制之一。

3.3 虎杖苷抑制肺癌细胞体外增殖和侵袭的信号转导通路 AKT/NF-κB 信号通路在细胞增殖和侵袭等多种细胞过程中起重要作用［12-14］。本研究表明，虎杖苷可以显著抑制细胞AKT 磷酸化（p-AKT）和NF-κB启动子活性，这可能是虎杖苷抑制肺癌细胞的另一个潜在机制。

综上，虎杖苷能够抑制肺癌A549细胞的体外增殖和侵袭及迁移，调节相关基因表达和信号通路，可能是治疗肺癌的潜在药物。本研究中，虎杖苷处理24 h实验结果还不够显著，72 h细胞死亡过多，影响展示真实结果，所以只采用具有代表性的48 h 时间点进行研究。A549 细胞是肺癌研究中的具有代表性的细胞系，今后将选取更多的细胞系进行研究。