白细胞介素-33 对脓毒症小鼠脾脏树突状细胞免疫功能的影响

阴 月 王丽雪 董 宁 吴 瑶 童亚林 祝筱梅 姚咏明

（1. 广西师范大学生命科学学院，广西 桂林 541006；2. 解放军总医院医学创新研究部创伤修复与组织再生研究中心，北京 100048；3. 解放军联勤保障部队第九二四医院烧伤整形科，广西 桂林 541002）

脓毒症是创烧伤、休克、感染等临床急危重患者的严重并发症之一[1]，病情进展迅速、预后凶险。近年来人们逐渐认识到，免疫功能紊乱可能是脓毒症的发病本质及病情进展的重要内因[2-3]，但其主要作用环节及有效调控途径仍不清楚。白细胞介素（IL）-33 是IL-1 家族新成员，在Ⅱ型免疫反应中发挥重要调控作用[4]，与感染状态下免疫抑制密切相关[5]。本研究旨在探讨脓毒症时IL-33 对体内专职抗原呈递细胞树突状细胞（DC）免疫功能的影响与意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料 BALB/c 小鼠，雄性，6 ～8 周，（20±2）g，购自北京华阜康公司。重组鼠IL-33蛋白和重组鼠可溶性IL-33 受体（sST2）蛋白（美国R&D Systems 公司），藻红蛋白- 花青素7（PE-Cy7)或别藻蓝蛋白（APE）标记CD80 抗体、藻红蛋白（PE）标记CD86 抗体及异硫氰酸荧光素（FITC）标记主要组织相容性复合物Ⅱ（MHC-Ⅱ）抗体（美国Biolegend 公司），IL-33 抗体（美国Abcam 公司），小鼠CD11c 阳性选择试剂盒（EasySepTMMouse CD11c Positive Selective Kit Ⅱ，加拿大StemCell 公司），β-actin（北京普利莱基因技术有限公司），RIPA 裂解缓冲液、蛋白酶抑制剂混合物、磷酸酶抑制剂混合物、超敏发光液A 和B 液（北京普利莱基因技术有限公司）。流式细胞仪（美国BD 公司），电泳仪（DYY-7，北京六一厂），凝胶成像系统Image Quant LAS 4000 （美国GE 公司）等。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠脓毒症模型复制及动物分组 小鼠随机分为3 组：假伤组、盲肠结扎穿孔（CLP）组和sST2 干预组。CLP 组复制小鼠脓毒症模型：小鼠禁食12 h，正常饮水；5%水合氯醛（200 μl/20 g）腹腔注射麻醉后固定于手术板上，用碘伏棉球在腹中部消毒3 次；沿腹中线剪开约0.5 cm 开口，暴露腹膜，再略微剪开暴露腹腔，在左上腹寻找盲肠，暴露盲肠；在盲肠1/2 处结扎，用针头在结扎段盲肠1/2 处贯穿1 次，挤出少许内容物，将盲肠放回腹腔中，将腹膜和皮肤逐层缝合，轻揉腹部防止肠管梗阻；术后即刻颈下注射生理盐水1 ml。sST2干预组于CLP 术后1 h 经腹腔注射重组sST2（每只10 μg，溶于200 μl PBS 中），CLP 组则给予200 μl PBS 腹腔注射；假伤组动物仅开腹暴露盲肠，不结扎穿孔，其余操作同CLP 组。

1.2.2 分离脾脏DC 取小鼠脾脏置于PBS 中冲洗并去除筋膜，撕碎并研磨脾脏组织，经70 μm 筛网过滤，1 500 r/min 离心5 min，弃上清，按照小鼠CD11c 阳性选择试剂盒操作说明，按比例依次加入各成分，充分反应后以PBS 重悬调整至适当体积并转移至圆底试管，放入磁铁中静置3 min，然后使用磁铁向一个方向迅速倾倒，倒掉液体，将试管取离磁场，轻弹管壁，加PBS 重悬，重复上述操作3 次。加PBS 重悬后1 500 r/min 离心 5 min，弃上清，收集细胞团重悬，以FITCCD11c 标记流式细胞术检测DC 纯度，结果显示可达90%以上。

1.2.3 脾脏DC 表面标志分子表达检测 收集各观察时间点小鼠脾脏DC，计数细胞每管2×105个，PBS 重悬吹散为单细胞悬液，按比例加入待测抗体（CD80、CD86 和MHC-Ⅱ抗体）混匀后4 ℃避光孵育30 min，PBS 润洗3 次，离心后加200 μl PBS 重悬，用流式细胞仪检测各标记物表达水平。

1.2.4 Western blot 检测脾脏IL-33 蛋白表达 于各观察时间点取小鼠脾脏组织称重，按1 ∶10 比例加入配置好的RIPA 裂解混合液（RIPA 裂解缓冲液∶蛋白酶抑制剂混合物∶磷酸酶抑制剂混合物=97 ∶2 ∶1）裂解提取总蛋白，测定蛋白浓度。配置12%的分离胶和5%的浓缩胶，每孔上样30 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），然后转至偏氟乙烯（PVDF）膜。用10% 脱脂牛奶室温封闭2 h 后，加IL-33 抗体（1 ∶1 000）、β-actin 抗体（1 ∶1 000）冰上孵育过夜。洗涤后，加二抗室温孵育1 h。洗涤，超敏发光液A、B 液1 ∶1 混合，曝光。

1.3 统计学处理 采用ImageJ 进行Western blot 灰度分析。采用GraphPad Prism 5 统计软件进行分析。计量资料以表示，两组间差异比较采用t 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CLP 小鼠脾脏DC 表面标志分子表达变化 CLP组小鼠分别在CLP 术后6、12、24、48、72 h 分离提取脾脏DC，流式细胞术检测DC 表面标志分 子及共刺激分子CD80、CD86、MHC-Ⅱ表达情况 （n=3）。结果显示，与假伤组相比，CLP 术后除CD80 表达水平有所升高（P＜0.01）外，CD86 和MHC-Ⅱ表达水平均呈现显著降低（P＜0.01），其中以术后72 h 降低尤为明显（P＜0.01，见图1）。提示脓毒症造成小鼠脾脏DC 成熟分化异常，功能抑制。

图1 CLP 后不同时间点脾脏DC 表面标志物表达变化（n=3）

2.2 CLP 小鼠脾脏IL-33 蛋白水平改变 复制小鼠脓毒症模型，分别于CLP 术后6、12、24、48、72 h 和5 d 处死小鼠，提取脾脏组织蛋白，Western blotting 检测小鼠脾脏IL-33 蛋白水平。结果显示，小鼠脾脏组织中IL-33 在CLP 术后24 h 表达明显增强，至72 h 仍持续于较高水平，CLP 术后5 d 表达逐渐降至正常范围（见图2）。

2.3 sST2 处理对小鼠生存率及脾脏DC 表面标志分子的影响 动物随机分为CLP 组（10 只）和sST2 干预组（10 只），记录小鼠死亡情况并于术后72 h 处死所有动物（CLP 组4 只，sST2 干预组5 只），分离提取脾脏DC，流式细胞术检测DC 表面标志物CD80、CD86、MHC-Ⅱ表达变化。结果显示，给予sST2 干预可以在一定程度上提高CLP 小鼠术后3 d 内存活率（见图3），并显著上调CLP 小鼠术后72 h 脾脏DC 表面分子CD80、CD86、MHC-Ⅱ表达水平（P＜0.01,见图4）。

图2 CLP 小鼠脾脏IL-33 蛋白水平改变（n=3）

图3 sST2 干预对CLP 小鼠存活率的影响（n=10）

2.4 重组IL-33 对脾脏DC 功能状态的直接影响 分离提取正常小鼠脾脏DC 体外培养，给予不同浓度重组IL-33（0、1、10、100 ng/ml）刺激，流式细胞术检测DC 表面标志物的表达。结果显示，10 ng/ml 的IL-33 刺激24 h 后，CD80 表达水平略有降低但差异不显著（P＞0.05），而CD86、MHC-Ⅱ表达水平有明显降低（P＜0.05，见图5）。

3 讨 论

脓毒症是感染后宿主反应失调引起的危及生命的器官功能障碍[6]。随着对脓毒症发病本质认识的加深，人们注意到，机体免疫紊乱或免疫功能降低是脓毒症发生发展的重要原因之一。处于免疫调控中心位置的专职抗原呈递细胞DC 在创烧伤后免疫功能障碍发病机制中具有重要意义，其数量减少及功能受抑参与机体免疫异常反应过程，在很大程度上影响着严重创（烧）伤感染并发症的结局[3,7]。本组资料显示，尽管CLP 小鼠脾脏DC 表面CD80表达在术后24 h 有所上调，CD86、MHC-Ⅱ表达水平均显著降低，成熟分化异常，处于功能抑制状态。

图4 sST2 干预对脾脏DC 表面标志物的影响

图5 重组IL-33 刺激对正常小鼠脾脏DC 表面标志物表达水平的影响（n=3）

IL-33 是IL-1 家族成员之一[8]，主要由上皮细胞和内皮细胞产生，在组织损伤及细胞坏死时释放至细胞外，除作为机体组织损伤的预警信号外，还可通过结合细胞表面ST2 受体调控条件性T 细胞[9]、Th17[10]、γδT[11]等免疫细胞的增殖分化，高效介导负向免疫调控，对机体抗感染、组织修复及免疫应答发挥重要的调节效用。在严重感染及炎症状态下，大量上皮细胞、内皮细胞坏死造成IL-33 释放量显著升高，可引起继发性组织损害及免疫紊乱[12]。本研究结果显示，CLP 术后24 h即可见小鼠脾脏组织中IL-33 蛋白水平明显升高，并持续维持高水平至伤后72 h，可能与腹腔感染后脓毒症的病理生理反应相关。据报道，IL-33 作为一个多功能蛋白分子可发挥抗炎作用，通过增强感染病灶的中性粒细胞浸润，增强细菌吞噬能力，有利于提高脓毒症小鼠存活率[13-14]。但另有资料提示，脓毒症状态下IL-33 能激活Ⅱ型固有淋巴样细胞，促进M2 巨噬细胞的极化，通过IL-10 增强调节性T 细胞群的扩增，进而诱导脓毒症免疫抑 制[12]。本研究利用重组IL-33 蛋白刺激体外培养的正常小鼠脾脏DC，发现一定刺激剂量的IL-33 可致DC 成熟分化障碍，脓毒症小鼠脾组织高水平IL-33可能是引发脾脏DC 功能抑制的重要因素之一。

业已明确，ST2 是IL-33 唯一确定的受体[15]，分为两种形式：一种为膜受体，其胞外区与IL-33结合后启动下游信号分子的激活以调控细胞功能分化；另一种为可溶性因子（sST2），缺乏跨膜和细胞内结构域，在循环系统充当IL-33 的诱饵受体，能与膜结合ST2 受体竞争性结合IL-33 而拮抗其生物学功能，阻止IL-33 的全身效应[16]。本实验结果显示，CLP 小鼠术后1 h 给予sST2 干预（每只10 μg），可有效改善术后1 ～3 d 小鼠存活率。于伤后72 h 检测可见脾脏DC 表面分子标志物CD80、CD86、MHC-Ⅱ表达水平均呈显著上调，提示拮抗IL-33 可激活DC 免疫功能状态，有效逆转了脓毒症小鼠脾脏DC 功能抑制状态，对脓毒症小鼠明确发挥了保护作用。

综上所述，本研究结果证实，CLP 术后脾脏组织IL-33 蛋白水平显著升高，对DC 功能具有直接负向调节效应；给予sST2 干预以拮抗IL-33生物学作用可明显改善脓毒症状态下DC 的功能状态。可见，IL-33 可直接诱导DC 成熟分化障碍，是诱导脓毒症后机体免疫功能紊乱的重要因素之一，针对IL-33 干预可能为脓毒症防治提供新思路。