不同酿酒酵母对骏枣果酒发酵特性的影响

邹 波，徐玉娟，肖更生，吴继军，余元善，唐道邦，温 靖

(广东省农业科学院 蚕业与农产品加工研究所/农业部功能食品重点实验室/广东省农产品加工重点实验室， 广东 广州 510610)

骏枣(ZizyphusjujubeMill. Cv. Junzao)是鼠李科枣属植物，广泛种植于我国新疆地区[1]。研究表明，骏枣具有极高的营养价值，富含碳水化合物、矿物质、维生素、氨基酸、多酚、多糖等营养成分[2-4]，并具有抗氧化、提高免疫力、护肝等功效[5-7]。

据报道，世界上90%的红枣产于我国，并且产量逐年上升[8]。新疆是我国红枣的主产区之一，据统计，2015年新疆红枣种植面积49.6万公顷，产量305万吨，位居我国首位[9]。作为新疆主栽品种之一的骏枣，目前主要以鲜食和枣干加工为主，其他形式的加工产品非常少见[8]。研究表明，骏枣的糖含量为60%～80%，加入适当的水分后，非常适合果酒的酿造[10-11]。尽管红枣发酵酒的研制已有少量报道，但多数枣酒是采用果胶酶解后进行发酵[12]，或者对红枣进行提汁后发酵[13]。红枣果胶含量高，酶解过程中易生成甲醇，质量难以控制，与用热水提取的枣汁发酵酒相比，酶解提汁的发酵酒甲醇含量上升了6倍以上[13]，并且直接采用提取汁液发酵，营养损失较大。

有研究表明，酿酒酵母的种类对果酒的品质有重要的影响。红枣在酿酒酵母的作用下，一方面产生酒精及多种风味物质，另一方面也可能产生对果酒品质不利的代谢产物，如甲醇、杂醇油等[14-15]。酵母对果酒品质的影响可能与酵母的发酵特性及红枣的营养成分有关；此外，酵母发酵对红枣的抗氧化能力等功能也具有一定的影响[6]。目前采用红枣浆直接进行酵母发酵的研究鲜见报道，本研究以骏枣浆为原料，利用气相色谱等分析手段，研究在不同商业化酿酒酵母的作用下，酒精度、甲醇、杂醇油、抗氧化能力等指标在发酵过程中的变化规律，以期为骏枣酿酒酵母的筛选提供科学指导和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

骏枣，购于新疆喀什；活性干酵母RV002，购自安琪酵母股份有限公司；活性干酵母BO213、FX10，购于法国Laffort公司；活性干酵母EC1118，购于烟台帝伯仕自酿机有限公司；没食子酸标准品，购于Sigma-Aldrich公司；正丙醇、异丁醇、异戊醇、4-甲基-2-戊醇(色谱纯)标准品，购自国药集团化学试剂有限公司；甲醇(色谱纯)，购自德国Meker公司；总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)测定试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；水为超纯水，其他试剂为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

GC- 2010Plus型气相色谱仪(配有AOC- 20i自动进样器和氢火焰离子检测器(FID))、UV- 1800型分光光度计，日本岛津公司；PB- 10型pH计，赛多利斯公司；RFM3400型数显折光仪，英国Bellingham+Stanley公司。

1.3 实验方法

1.3.1骏枣果酒发酵工艺流程

骏枣果酒发酵工艺流程见图1。

骏枣清洗→去核→浸泡→打浆→成分调整→接种→发酵

图1 骏枣果酒发酵工艺流程

Fig.1 Routing of Jun-jujube wine fermentation

1.3.2发酵操作要点

原料预处理：骏枣洗净后去核，用80 ℃水(骏枣与水的比例为1∶4)浸泡1 h，然后打浆。

成分调整：骏枣浆中添加白砂糖和柠檬酸，最终总可溶性固形物(total soluble solid，TSS)为23°Brix，总酸为5 g/L，添加亚硫酸钠50 mg/kg。

接种发酵：酵母活化后加入到枣浆中，活性干酵母的添加量为0.25 g/kg。发酵温度控制在(25±1) ℃，发酵前3 d每天搅拌3次，3 d后停止搅拌。

1.3.3总可溶性固形物、酒精度、pH值、总酸的测定

分别取发酵0，2，4，7，10 d的样品，100目滤布过滤后采用数显折光仪测定TSS含量，pH值用pH计直接测定，总酸(total acids，TA)根据GB/T12456—2008《食品中总酸的测定》中酸碱中和滴定法[16]测定，酒精度的测定根据GB5009.225—2016《酒中乙醇浓度的测定》中酒精计法[17]进行。

1.3.4甲醇、杂醇油含量的测定

甲醇、杂醇油含量的测定：准确称取甲醇、正丙醇、异丁醇、异戊醇、4-甲基-2-戊醇标品500 mg，用10%乙醇溶液定容到10 mL，该溶液用于定性分析。

混合标准溶液的配制：将甲醇、正丙醇、异丁醇、异戊醇溶液混合，加入10%乙醇，使各标准品的最终质量浓度为50、125、250、500、1 000 mg/L；取不同质量浓度的混合标准溶液10 mL，加入0.1 mL 4-甲基-2-戊醇溶液(内标)。

样品的制备：枣酒在10 000 r/min条件下离心10 min，取上清液10 mL，加入内标4-甲基-2-戊醇溶液0.1 mL，采用0.22 μm滤膜过滤后进行气相色谱分析。

气相色谱条件：色谱柱为DB- FFAP聚乙二醇强极性柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；程序升温模式为起始温度40 ℃，保持5 min，以3 ℃/min升温至50 ℃，保持3 min，以8 ℃/min升温至120 ℃，保持1 min，再以20 ℃/min升温至240 ℃，保持3 min；检测器温度为250 ℃；进样口温度为250 ℃；载气(N2)流速1.0 mL/min；进样量1.0 μL；分流比为20∶1。

定量分析采用内标加入法，以4-甲基-2-戊醇为内标，以甲醇和各杂醇油峰面积与内标的比值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。样品中的甲醇和杂醇油的含量根据标准曲线计算。

1.3.5总酚含量的测定

样品用5倍体积的HCl-甲醇(体积比为1∶99)超声提取10 min，然后10 000 r/min离心10 min，收集上清液，沉淀重复提取1次，合并提取液。总酚含量采用Folin-Ciocalteu法[18]进行测定，以没食子酸为标准对照品，绘制标准曲线，骏枣酒中总酚含量以没食子酸当量(gallic acid equivalent，GAE)表示。

1.3.6总抗氧化能力的测定

总抗氧化能力按照总抗氧化能力(T- AOC)测定试剂盒的方法进行。在37 ℃时，将单位时间(min)、单位体积(mL)样品使反应体系的吸光值每增加0.01个总抗氧化能力单位，作为样品的总抗氧化能力，以U/mL表示。

1.4 数据处理

实验均设置3次平行，数据以均值±标准差表示，采用Origin 8.05软件进行图形绘制。

2 结果与分析

2.1 不同酵母对骏枣果酒发酵过程中TSS、酒精度、pH值和TA的影响

骏枣果酒发酵过程中TSS、酒精度、pH值和TA的变化结果如图2。图2(a)、(b)中，发酵前4 d，4种酵母均快速消耗碳水化合物，导致TSS快速下降，其中EC1118和RV002组前4 d的TSS下降速度明显快于BO213和FX10组；发酵第4天至第10天，EC1118和RV002组的TSS无明显变化，而BO213和FX10组呈现缓慢下降趋势。与之对应的，发酵前4 d，EC1118和RV002组酒精度快速上升，分别从0增加至9.30%和9.6%，10 d后酒精度分别为11.68%和11.89%；而BO213和FX10组发酵8 d后酒精度增速变缓，10 d后酒精度不再上升，最终酒精度分别稳定在11.05%和10.84%，因此后续的理化指标检测取样从0 d到10 d。

图2(c)和(d)中，pH值略微下降，TA轻微上升，整体变化不明显。这说明不同种类的酿酒酵母对骏枣果酒的酸度影响不大。

图2 骏枣果酒发酵过程中TSS含量、酒精度、pH值、TA的变化Fig.2 Changes in TSS, alcohol content, pH, and TA of Jun-jujube wine during fermentation

2.2 不同酵母对骏枣果酒发酵过程中甲醇和杂醇油的影响

甲醇是果酒中对人体有害的微量成分。甲醇对视觉神经和中枢神经系统具有破坏作用，可导致头晕、失明，甚至死亡[19]。杂醇油是一类碳原子数超过2的醇类化合物，主要包括正丙醇、正丁醇、异丁醇、异戊醇等，也叫高级醇[20]。研究表明，杂醇油较难被人体代谢，在机体内停留时间较长，是导致饮酒上头的主要物质[14,20]。骏枣酒中甲醇和杂醇油的气相色谱如图3。从图中可以看出，骏枣酒中含有甲醇、正丙醇、异丁醇和异戊醇。

1.甲醇； 2.乙醇； 3.正丙醇； 4.异丁醇； 5.4-甲基-2-戊醇(内标)； 6.异戊醇。图3 FX10发酵的骏枣果酒甲醇和杂醇油的气相色谱Fig.3 Gas chromatogram of methanol and fusel oil of Jun-jujube wine fermented by FX10

骏枣果酒发酵过程中甲醇的变化如图4。发酵2 d后，甲醇浓度从高到低依次为RV002、EC1118、FX10和BO213；发酵2～10 d，FX10甲醇含量没有明显变化，其他3组均有所下降；发酵结束后，以BO213甲醇含量最低，质量浓度为7.52 mg/L。本研究与张丽芝[12]、张宝善等[13]的研究有所不同，这可能与原料的前处理工艺不同有关，前者采用的是酶解后的枣汁进行发酵，后者采用的是热水浸提的红枣提取液进行发酵，本研究采用的是红枣原浆直接进行发酵。红枣酒中甲醇的来源主要有两种：一种是果胶水解后产生，这也是最主要的来源；另一种是甘氨酸脱氨基和羧基降解后形成[19]。由于骏枣含有大量的果胶成分，因此控制枣酒中甲醇的含量尤为重要。不同的酿酒酵母对果胶及甘氨酸的分解能力有所差异，本研究结果表明，酒精发酵速度快时，枣酒中甲醇含量相对也高一些，这与前人报道的结果一致[12]。

图5 骏枣果酒发酵过程中杂醇油含量的变化Fig.5 Changes in fusel oil contents of Jun-jujube wine during fermentation

图4 骏枣果酒发酵过程中甲醇含量的变化Fig.4 Changes in methanol contents of Jun-jujube wine during fermentation

骏枣果酒发酵过程中杂醇油含量的变化情况如图5。图5(a)中，发酵过程中正丙醇浓度均呈先增加后降低的趋势，发酵结束后，以EC1118组正丙醇浓度最高，其次是RV002组，两者的正丙醇质量浓度均超过200 mg/L；相对而言，BO213组和FX10组正丙醇质量浓度较低，分别为53.57 mg/L和90.30 mg/L。图5(b)中，FX10组异丁醇的变化最大，发酵前7 d快速上升，10 d后升至60.10 mg/L，其他3组变化较小，其中以BO213组变化最小，发酵10 d后异丁醇的质量浓度为12.70 mg/L。图5(c)中，发酵过程中异戊醇的变化与异丁醇的变化趋势类似，发酵10 d后，FX10组异戊醇质量浓度最高，为950.00 mg/L；BO213组质量浓度最低，为202.33 mg/L。图5(d)中，随着发酵时间的延长，杂醇油呈现先上升后下降的趋势，发酵10 d后，杂醇油的质量浓度从高到低依次为FX10、EC1118、RV002、BO213(268.6 mg/L)。

杂醇油是酵母果酒发酵过程中的副产物，主要来源于氨基酸代谢和糖代谢[14]。众多研究表明，酵母的种类对杂醇油的生成影响较大[10,15,21]。王宓等[21]研究了6种酵母对红枣白兰地原料酒杂醇油的影响，发现不同酵母菌发酵的红枣白兰地，杂醇油的含量存在明显差异，以安琪耐高温酿酒高活性干酵母产生的杂醇油含量最低。张丽芝[12]研究了3种酵母对发酵枣酒中杂醇油的影响，结果表明，采用实验室分离的葡萄酒酵母菌发酵的红枣酒，杂醇油含量最低。Aragon等[22]的研究也表明，酵母的种类对杂醇油的生成影响较大。

2.3 不同酵母对骏枣果酒发酵过程中总酚和抗氧化能力的影响

骏枣果酒发酵过程中总酚的变化如图6。整个发酵过程中，总酚含量没有明显的变化，不同组别之间差异不大。发酵10 d后总酚质量浓度为1.50～1.56 g/L。骏枣果酒发酵过程中总抗氧化能力的变化如图7，随着发酵时间的延长，各组发酵的总抗氧化能力逐渐上升，发酵10 d后，BO213组和FX10组总抗氧化能力明显高于EC1118组和RV002组。发酵期间，抗氧化能力与总酚没有明显的相关性，说明酵母的生长代谢活动对骏枣果酒的抗氧化能力有较大影响。

图6 骏枣果酒发酵过程中总酚质量浓度的变化Fig.6 Changes in total phenolic contents of Jun-jujube wine during fermentation

图7 骏枣果酒发酵过程中总抗氧化能力的变化Fig.7 Changes in total antioxidant capacities of Jun-jujube wine during fermentation

研究表明，酵母发酵可影响水果的抗氧化能力[6]。酵母可以促进植物细胞内溶物的释放，并将黄酮类化合物降解成抗氧化能力更强的酚酸类物质。Wang等[23]研究了桑果发酵过程中抗氧化能力的变化，结果发现，不同品种的桑果在酵母发酵过程中，DPPH自由基清除能力和铁离子还原能力均上升；郑娇等[15]和Zou等[24]也有类似的报道。此外，酵母的种类对抗氧化能力也有较大影响，不同的酿酒酵母，其发酵果酒的抗氧化能力也不尽相同。研究表明，采用3种酵母菌(BV818、ICV254 和CY3079)制备的海红果酒，其清除DPPH自由基能力和还原能力各不相同[15]，本研究结果与之相似。

3 结 论

对4种酿酒酵母发酵的骏枣果酒进行了各项理化指标和总抗氧化能力的研究，结果表明，发酵期间TSS、酒精度变化明显，其中以EC1118和RV002酵母酒精发酵速度较快，BO213和FX10发酵速度较慢。气相色谱分析结果表明，RV002发酵的枣酒甲醇含量高，FX10发酵的枣酒杂醇油含量高，而BO213发酵的枣酒甲醇和杂醇油含量均较低。随着发酵的进行，各种酿酒酵母均能增加枣酒的抗氧化能力，以BO213发酵的枣酒总抗氧化能力最高。本研究结果说明，酿酒酵母BO213产酒能力较好，产甲醇和杂醇油的能力低，抗氧化能力高，是这4种酵母菌中最适合骏枣果酒发酵的菌种。

骏枣果酒发酵结束后还需要进行澄清处理，因枣浆黏度较高，后续可进一步研究骏枣果酒的澄清工艺和稳定性，以期为骏枣果酒的开发提供更为充分的参考依据。