固相萃取-高效液相色谱法测定水中磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲基异噁唑的方法探究

杨舒婷，林伟锐，梁建华，黎大端，操江飞，谢春生

（1.肇庆学院 环境与化学工程学院，广东 肇庆 526061；2.肇庆市环境保护监测站，广东 肇庆 526040）

1932年药理学家Domagk发现含有磺胺类的偶氮染料，标志着磺胺类药物(sulfonamides，SAs)问世，随后得到了快速发展[1].SAs属于化学合成的抗生素，是由氨苯横胺衍生而来的一类化学合成广谱抗菌药[2]，能在极低浓度下选择性地抑制或影响其他生物功能的有机物质[3]，目前广泛应用于医药行业、水产养殖、畜牧业等方面，这也是SAs污染的来源[4].医药行业产生的SAs主要来源于制药废水、医院及家庭用药产生的废水，其中制药废水中SAs浓度较高[5].研究表明，大部分人体或动物体内的抗生素都以原药和代谢产物的形式由粪便和尿液排出体外，通过各种途径进入水环境中[6].残留的抗生素将会使病原体产生抗性基因，导致抗生素治疗疾病的效力不断下降，且耐药性致病菌不断增加与扩散.由于抗生素对环境存在诸多潜在危害，其环境归趋及生态效应在国内外引起广泛的关注，成为当前国际研究的热点领域[7].

在水环境中残留的SAs的浓度随时空分布有所不同，大多数集中在ng/L～μg/L痕量级水平，国内外较多采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）[8-9]监测，但液相色谱-质谱联用检测设备及费用昂贵，对监测方法的推广应用造成了一定的困难.近年来，随着高效液相色谱及预处理技术的进步，应用高效液相色谱开展地下水和地表水中磺胺类抗生素监测也取得了成功[10-11].然而，水环境样品复杂多样，除了地下水，还有各种类型的地表水和废水样品；因此，建立复杂水环境样品中磺胺类抗生素简便、低廉、适用性广的检测方法是对其加强监测管理的关键.研究分别采用全自动固相萃取仪富集水体中的磺胺类抗生素，结合高效液相色谱HPLC测定，实现了对水体中2种磺胺类抗生素进行快速、有效的检测.

1 实验部分

1.1 实验仪器和试剂

高效液相色谱仪（LC-20AB，日本岛津公司）配有紫外检测仪,色谱柱为ODS-SP(4.6mm×150mm,5um，岛津-GL上海商贸有限公司)；全自动固相萃取仪（CLEVER，上海屹尧仪器科技发展有限公司）,萃取柱为PEP-2SPE（500mg/6mL）；电子分析天平（CP224S，德国赛多利斯）；超纯水机（Milli-Q Reference,Millipore公司）；超声波清洗机（5200，宁波新芝生物科技股份有限公司）.

磺胺二甲嘧啶(Sulfamethazine，SM2)、磺胺甲基异噁唑(Sulfamethoxazole，SMZ)标准品，为广州分析测试中心科力技术开发公司生产；甲醇(色谱纯,纯度＞99.9%，Dikma公司）；甲酸(分析纯,天津市广成化学试剂有限公司）；实验用水为去离子水.

1.2 色谱条件

色谱柱：ODS-SP(4.6mm × 150mm,5um)；流动相∶0.1%甲酸：甲醇（V∶V=70∶30）；高效液相色谱的检测波长270nm；柱温30℃；流速为0.6mL/min；进样量20μL；检测器为紫外检测器.

1.3 样品前处理

分别用5 mL甲醇和5mL纯水活化固相萃取柱，保证小柱柱头浸润.量取1000 mL水样，以5 mL/min的流速通过小柱.待水样全部通过小柱后，吹干小柱.用10 mL甲醇以约1 mL/min的流速洗脱小柱，洗脱液接收于收集管中.

洗脱液经氮气吹至1.0 mL以下，用甲醇定容至1.0 mL，于-10℃以下避光保存.

1.4 标准溶液的配置

标准储备液：准确称取10.0mg磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲基异噁唑标准品，溶于10mL甲醇中，最终浓度为1 000mg/L.储备液应在-10℃以下避光保存，使用时应恢复至室温，并摇匀.

标准使用液：将2种抗生素类化合物标准储备液按需要用甲醇稀释至1 mg/L.标准使用液在-10℃以下避光保存.使用时应恢复至室温，并摇匀.

混标工作液：准确移取上述标准使用液，用甲醇稀释至5、10、20、50、200、500 μg/L.

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

由于磺胺二甲基嘧啶和磺胺甲基异噁唑性质差别不大，采用HPLC检测时要对其流动相进行优化，确保2组分完全分离.磺胺类药物分子结构中的氨基具有弱碱性，通过调节流动相的pH值，可以抑制弱碱的解离，从而改变组分的保留时间，改善其分离度[12].研究表明，酸度较高会导致磺胺类药物难以达到基线分离；酸度过低时，色谱的峰型不尖锐，各组分有严重的拖尾现象[12-13].

图1 磺胺二甲基嘧啶和磺胺甲基异噁唑典型HPLC谱图(500μg/L标准液)

尝试以水：甲醇（V∶V=70∶30）、0.1%甲酸∶甲醇（V∶V=20∶80）、0.1%甲酸∶甲醇（V∶V=40∶60）、0.1%甲酸∶甲醇（V∶V=50∶50）、0.1%甲酸∶甲醇（V∶V=70∶30）作为流动相分离混标工作液，发现流动相为水：甲醇（V∶V=70∶30）、0.1%甲酸∶甲醇（V∶V=20∶80）时，色谱峰不能完全分离；流动相为0.1%甲酸∶甲醇（V∶V=40∶60）、0.1%甲酸∶甲醇（V∶V=50∶50）时，峰型较宽且伴随拖尾现象；流动相为0.1%甲酸∶甲醇（V∶V=70∶30）时，实现了2组分基线的完全分离，且分离度大，峰型尖锐，对称性好，并获得适宜的保留时间(见图1)，故最终选用0.1%甲酸∶甲醇（V∶V=70∶30）作为流动相.流动相使用前超声20 min，以免影响液相色谱的测定.

2.2 进样量的选择

进样量的大小决定响应信号的强弱，增大进样量可相应增强信号强度，从而增加色谱峰的峰高，使待测物质的检出限及测定下限更低[13].实验结果表明，进样量为1μL时，响应信号容易受到干扰，且标准曲线的测定下限较高，实际水体中磺胺类抗生素的含量较低，远远低于该方法的检测范围；采用20μL为进样量时，发现2种SAs在5～500 ng/L浓度范围内出峰效果良好，检出限明显降低，适用于实际水体的测定.因而，最终选取20μL的进样量.

2.3 紫外吸收波长的选择

在磺胺二甲基嘧啶和磺胺甲基异噁唑结构中均有苯环，在紫外条件下有特征吸收[10].高效液相色谱法检测某种单一组分时采用该组分的最大特征吸收波长即可，而对于多组分残留检测，因为不同磺胺类抗生素的最大吸收波长不同，最终检测波长必须兼顾多种药物均获得较好的灵敏度[14].磺胺类在270 nm附近有强吸收[11]，磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲基异噁唑的最大特征吸收峰分别为269.20nm[14]、270 nm.最终选用270 nm作为检测波长，吸收峰峰型对称，干扰因素小，灵敏度高.

2.4 流速的选择

在波长、流动相等测量条件一定的情况下,分别设置流速为0.5、0.6、0.8、1.0 mL/min进行检测.发现在两组分分离程度大的前提下，流速为0.6 mL/min时，峰型尖锐，对称性好，且SM2、SMZ的出峰时间分别为7.5、14.9min，出峰时间较早.故选择0.6 mL/min作为检测流速.

2.5 方法的线性范围及其检出限

定性分析方法采用标准样品的保留时间来进行.定量采用外标法，以HPLC测得的峰面积Y为纵坐标，相应的浓度X为横坐标,绘制标准曲线，所得标准曲线和相关参数见表1.结果表明，SM2、SMZ在5～500 ng/L范围内具有极好的线性关系，相关系数R²＞0.9995，完全可以满足定量分析的需要.

检出限为某特定分析方法在给定的置信度内可从样品中检出待测物质的最小浓度或最小量.选定某个低浓度的加标样品，在相同条件下，重复进样7次，将各测定结果换算为样品中的浓度，计算方法检出限（MDL=t（n-1,0.99）×S）.实验结果表明，当取样量为1 L时，SM2、SMZ的方法检出限为1.29 ng/L、1.59ng/L.

表1 2种抗生素的线性关系、相关系数和检测限

2.6 仪器的精密度和准确度

精密度是指在规定条件下，相互独立的测试结果之间的一致程度，通常用相对标准偏差（RSD）衡量；准确度则是指测试结果与被测量真值或约定真值间的一致程度，通常用相对误差（RE）衡量.选定某一浓度的加标样品，在相同条件下重复进样6次，SM2、SMZ的相对标准偏差分别为3.01%、3.70%，相对误差分别为0.68%、7.16%，均满足仪器精密度和准确度的要求，详见表2，说明本方法适用于环境样品中SM2、SMZ测定.

2.7 加标回收率及测定下限

在空白样品中加入特定浓度的混标工作液，进行加标回收试验.发现SM2、SMZ的加标回收率较高，分别为78.1%～127.0%、62.7%～85.7%.

测定下限指在限定误差能满足预定要求的前提下，用特定方法能够准确定量测定被测物质的最低浓度或含量.以4倍检出限浓度作为测定下限（RQL），即SM2、SMZ检测下限为5.17 ng/L、6.35 ng/L.

表2 不同质量浓度的磺胺类抗生素的实测浓度

2.8 实际水样的测定

研究采用SPE-HPLC方法对水环境中SM2、SMZ的赋存情况进行调查，主要考察某企业废水排污口、工业排口、某养殖排渠、某村河段、某河流等，各采样点的检测浓度详见表3.发现SMZ在某企业废水排污口、工业排口、某养殖排渠均有检出，检出浓度分别为135.1、137.5、142.6 ng/L；某村河段、某河流的SM2含量分别为32.2、223.7 ng/L.与国内其它地区相比，本研究水体中SM2、SMZ的浓度水平与珠江广州段(4～323 ng·L－1)水体中的浓度相当[4].

表3 水体中2种 SAs的检出浓度 ng/L

3 结论

利用固相萃取－高效液相色谱法，实现了对实际水体中磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲基异噁唑的同时检测.该方法前处理简单，分离效果好，具有快速简便、灵敏度高、成本低、回收率高、定性效果好等优点，可满足实际工作的需要，为调查我国水体中抗生素的含量水平及其分布提供了依据.

（1）建立了高效液相色谱法同步测定SM2、SMZ的分析方法.色谱条件：流动相为0.1%甲酸：甲醇（V∶V=70∶30）；检测波长为270nm；柱温为30 ℃；流速为0.6mL/min；进样量为20μL.

（2）该方法精密度及准确度均较高，SM2、SMZ的检出限分别为1.29、1.59 ng/L，测定下限为5.17、6.35 ng/L，加标回收率范围分别为78.1%～127.0%、62.7%～85.7%，适用于环境样品中磺胺类抗生素测定.