金属-有机框架Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O的性能及其装载洛贝林药物的基础研究

邓临新 李 崧

(1.云南警官学院，云南·昆明 650223；2.云南农业大学，云南·昆明 650221)

前言

金属有机框架材料(Metal Organic-Framworks)作为先进前沿材料中的一种，是近十几年来配位化学发展的最快的一个方向。它具备超分子网状的结构并结合了复合高分子和配位化合物两者的特点，且兼具无机化合物和有机化合物两者的优点[注]Li， W. B.; Yang， Z. H.; Zhang， G. L.， et al.， Stiff metal-organic framework-polyacrylonitrile hollow fiber composite membranes with high gas permeability [J]. J Mater Chem A 2014， 2(7): 2110-2118. Li， G. Y.; Zhang， B.; Yan， J.， et al.， The directing effect of linking units on building microporous architecture in tetraphenyladmantane-based poly(Schiff base) networks [J]. Chem Commun 2014， 50(15): 1897-1899.。此类框架材料的结构可实现多样化的设计及实现可调控的孔道大小与结构，因此可以实现半定向设计合成[注]Ji， Q.; Lirag， R. C.; Miljanic， O. S.， Kinetically controlled phenomena in dynamic combinatorial libraries [J]. Chem Soc Rev 2014， 43(6): 1873-1884. Hasell， T.; Culshaw， J. L.; Chong， S. Y.， et al.， Controlling the Crystallization of Porous Organic Cages: Molecular Analogs of Isoreticular Frameworks Using Shape-Specific Directing Solvents [J]. J Am Chem Soc 2014， 136(4): 1438-1448.。此类分子功能材料研究跨越了晶体学、材料学、无机化学、配位化学、有机化学等诸多领域并成功实现领域交叉[注]Chen， X. W.; Wan， L.; Huang， J. M.， et al.， Nitrogen-containing carbon nanostructures: A promising carrier for catalysis of ammonia borane dehydrogenation [J]. Carbon 2014， 68: 462-472. Zhang， W.; Jin， Y. H.; Yang， H. S.， et al.， Development and applications of 3D covalent organic polyhedrons (COPs) and porous polymer frameworks (PPFs) through dynamic covalent chemistry [J]. Abstr Pap Am Chem S 2013， 246-249. Yuan， Y.; Sun， F. X.; Zhang， F.， et al.， Targeted Synthesis of Porous Aromatic Frameworks and their Composites for Versatile， Facile， Efficacious， and Durable Antibacterial Polymer Coatings [J]. Adv Mater 2013， 25(45): 6619-6624.。

金属有机框架材料作为一种新型纳米多孔材料，与活性炭和沸石比较，在气体的捕获、储存与分离[注]Yan， W.; Song-Quan， S.; Ju-Hong， Z.， et al.， Synthesis， structural diversities and properties of a series of transition metal-organic frameworks based on asymmetric dicarboxylic acid and N-donor auxiliary ligand [J]. Inorg Chem Commun 2013， 30: 5-12.[注]Li， Y. W.; Yang， R. T.， Hydrogen storage in metal-organic and covalent-organic frameworks by spillover [J]. Aiche J 2008， 54(1): 269-279.[注]Bureekaew， S.; Sato， H.; Matsuda， R.， et al.， Control of Interpenetration for Tuning Structural Flexibility Influences Sorption Properties [J]. Angew Chem Int Edit 2010， 49(42): 7660-7664.；药物的缓释[注]Dinca， M.; Han， W. S.; Liu， Y.， et al.， Observation of Cu2+-H2 interactions in a fully desolvated sodalite-type metal-organic framework [J]. Angew Chem Int Edit 2007， 46(9): 1419-1422.；光、磁、电科学[注]Lassig， D.; Lincke， J.; Moellmer， J.， et al.， A Microporous Copper Metal-Organic Framework with High H2 and CO2 Adsorption Capacity at Ambient Pressure [J]. Angew Chem Int Edit 2011， 50(44): 10344-10348.，催化科学[注]Lee， Y. G.; Moon， H. R.; Cheon， Y. E.， et al.， A comparison of the H2 sorption capacities of isostructural metal-organic frameworks with and without accessible metal sites: [{Zn2(abtc)(dMf)(2)}(3)] and [{Cu2(abtc)(dMf)(2)}(3)] versus [{Cu2(abtc)}(3)] [J]. Angew Chem Int Edit 2008， 47(40): 7741-7745.[注]Li， B. Y.; Zhang， Z. J.; Li， Y.， et al.， Enhanced Binding Affinity， Remarkable Selectivity， and High Capacity of CO2 by Dual Functionalization of a rht-Type Metal-Organic Framework [J]. Angew Chem Int Edit 2012， 51(6): 1412-1415.，手性拆分[注]Duan， J. G.; Yang， Z.; Bai， J. F.， et al.， Highly selective CO2 capture of an agw-type metal-organic framework with inserted amides: experimental and theoretical studies [J]. Chem Commun 2012， 48(25): 3058-3060.[注]Lin， Q. P.; Wu， T.; Zheng， S. T.， et al.， A chiral tetragonal magnesium-carboxylate framework with nanotubular channels [J]. Chem Commun 2011， 47(43): 11852-11854.等应用领域都表现非常出色并有巨大的应用潜力，已成为新型功能材料的研究热点。

洛贝林是从山梗菜中提取出来的一种生物碱，它是中枢兴奋药的一种，可以做到选择性地刺激颈动脉体中的化学感受器，反射性引起迷走神经中枢、呼吸中枢与血管运动中枢兴奋[注]Roni M A， Rahman S. Lobeline attenuates ethanol abstinence-induced depression-like behavior in mice.[J]. Alcohol， 2017， 61.。在洛贝林的应用过程中应该严格控制剂量的大小，因为洛贝林在使用剂量增大的同时，对大脑皮质、迷走神经中枢等的作用也随之增大，不良反应也会增加，症状严重的可引起惊厥[注]Da C E S L， Rodrigues L C， Dos Santos V R， et al. Evaluation of mutagenic and genotoxic activities of lobeline and its modulation on genomic instability induced by ethanol.[J]. Life Sciences， 2014， 103(2):73-78.。

Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O是一种新型3D多孔MOFs材料，本课题组前期已对其进行吸附N2、Ar2和多种有机分子的研究，但尚未见文献报道其作为药物载体的研究。据此，本文采用洛贝林为模型药物，采用两因素优化载药制备工艺，考察了载药Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O的体外释药特性及体外细胞毒性实验，为其作为药物载体的开发应用提供了依据。

一、实验部分

(一)所用仪器

红外光谱测试仪器(Nicolet Impact 410 FT-IR红外仪)；粉末XRD测定仪器(Siemens D5005 型X-射线衍射仪)；单晶衍射数据(Rigaku/MSC Mercury CCD单晶衍射仪)；热失重(TGA)测定(TGA/SDTA851e 热解重量分析仪)；荧光光谱测定仪器(Perkin-Elmer LS55型荧光光谱仪)；HEPA Class 100 CO2培养箱( Thermo电子公司) ，振荡恒温器(SPX-100B-D，上海薄迅实业有限公司医疗设备厂) ; 高温恒温试验箱( GHX-30，无锡科隆实验设备有限公司)。

(二)合成金属有机框架Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O

1.合成配体(E)-二(对3-硝基苯甲酸)乙烯(C16H10N2O8)

图1 (E)-二(对3-硝基苯甲酸)乙烯(C16H10N2O8)结构图

图2 (E)-二(对3-硝基苯甲酸)乙烯(C16H10N2O8)合成路线

将200mL 浓硫酸倒进400ml烧瓶，0℃冰水浴下，边搅拌边加入100ml发烟硝酸。然后将分小份加入10g对氯甲基苯甲酸，反应90分钟后对氯甲基苯甲酸完全溶于混酸，将瓶中所有物体倒入600ml冰水中，析出大量白色固体。过滤并洗涤残留混酸，所的物于甲苯溶剂中重结晶。得到化合物3-硝基对氯甲基苯甲酸白色晶体，烘箱烘干收集(89%)。

50ml无水乙醇倒进300ml烧杯，将5.7g(0.0970mol)KOH溶解于无水乙醇。接着倒入5.00g(0.0230mol)3-硝基对氯甲基苯甲酸，生成棕色沉淀，为(E)-二(对3-硝基苯甲酸)乙烯的钾盐。室温反应45min后真空抽滤并把所得固体于70ml水中溶解。加HCl于该水溶液到pH=1并形成沉淀。收集固体，用四氢呋喃溶剂重结晶，黄色晶体(E)-二(对3-硝基苯甲酸)乙烯(C16H10N2O8)化合物获得，烘箱烘干收集(78%)。

2.合成化合物Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O

把配体(E)-二(对3-硝基苯甲酸)乙烯(C16H10N2O8)(0.15mmol)、4,4’-联吡啶(BPY，0.15mmol)、硝酸锌(Zn(NO3)2·6H2O，0.15mmol)、乙醇2ml、H2O 10ml放到50ml高压反应釜里，调pH为9，超声， 150℃两天。过滤并洗涤后可获得菱形黄色晶体(E)-二(对3-硝基苯甲酸)乙烯。元素分析：C 52.45, N 9.34,H 3.11, Zn 10.89%；理论值：C 52.37, N 9.40,H 3.02, Zn 10.98%。该产物组成为： C26H18N4O9Zn(595.81)。

(三)测定结构

用Bruker Smart-1000 CCD 单晶X射线衍射分析仪对Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O单晶数据进行测试。晶体结构解析和结构精修是 SHELXTL 软件。Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O的主要晶体学数据列详见下表。

表1 Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O的晶体学数据和结构修正条件

(四)Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O载入洛贝林

1.绘制标准曲线

准确称适量洛贝林，以甲醇溶剂配制溶液。用溶剂作空白，波长扫描寻找最大吸收峰为249nm。然后配制标准溶液浓度梯度，建立在此波长处的吸光度(A)和浓度(c)的标准曲线。该标准曲线适用于载药环境。

与上述操作同，以pH=7.4磷酸盐缓冲液(PBS)为溶剂配制适宜浓度洛贝林溶液，以PBS为空白对照，建立吸光度(A)和浓度(c)的标准曲线。该标准曲线适用于释药环境。

2.洛贝林载入

准确称取干燥活化后的Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O 2mg，加入含有10mg洛贝林的1mL甲醇溶液中，超声混匀，作用24h，离心反应液(10000rpm，10min)，取上清液 100 μl ，稀释到 10mL(100 倍)，测其 249 nm 下吸光度，并计算 Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O 载药量。

载药量 = (MOFs内药量/MOFs总质量)×100%

(五)Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O体外释放洛贝林性能测定

取 2 mg 装载有洛贝林的Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O，放到20 mL PBS 缓冲溶液里，此为实验组。另取 1.16 mg Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O，放到 20 mL PBS缓冲液中，此为空白组。在(37±1℃)恒温振荡器中(振荡速度 100r.min-1)，每间隔12h取1mL 溶液并加入等量新鲜 PBS 缓冲液，将取出的溶液离心操作(12000rpm, 20min)后，取上清液用紫外光谱测定其吸光度，根据所建立的洛贝林标曲计算溶液中洛贝林含量，绘制累积释放量与时间关系曲线，考察载药后的Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O体外释放洛贝林性能。

(六)Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O细胞毒性实验

采用含10% 的胎牛血清RPMI 1640培养液来培养Hela细胞，取用处于对数生长期、生长状态好的Hela细胞，并用0.25% 的胰蛋白酶消化细胞，离心操作使细胞沉淀，用含10%胎牛血清RPMI 1640培养液配制细胞悬浮液，细胞密度1×105个·mL-1，以每孔104个细胞接种到96孔培养板里(6个复孔)，每孔100μL，把培养板转移到培养箱，37℃、5% CO2以及饱和湿度条件下培养24h后更换100μL RPMI1640培养液。实验分3组:空白对照(不加细胞)、阴性对照(细胞，不加Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O)、Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O(加细胞，加Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O)。加入各组药液各100μL，使质量浓度分别为200，100，50，25，12，6μg·mL-1，继续培养48h，每孔更换100μL RPMI 1640培养液，加20μL MTT 溶液(5mg·mL-1)，微量振荡器上振荡20 min，继续培养24h，除掉培养液，每孔加150μL DMSO，酶联免疫检测测定于490nm 处的吸光度(A)，可计算细胞存活率[注]Li, B. Y.; Zhang, Z. J.; Li, Y., et al., Enhanced Binding Affinity, Remarkable Selectivity, and High Capacity of CO2 by Dual Functionalization of a rht-Type Metal-Organic Framework [J]. Angew Chem Int Edit 2012, 51(6): 1412-1415.。

存活率%=(药物组-空白组)/(阴性对照组-空白组)×100%

二、性质研究与结果和讨论

(一)Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O晶体结构

X射线单晶结构测试结果表明Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O晶体为三斜晶系、P-1空间群，其次级构筑单元中含有两个Zn(Ⅱ)离子和两个配体(E)-二(对3-硝基苯甲酸)乙烯，还有两个配体联吡啶。图3表示了Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O的金属配位环境。从中能看出，Zn1与Zn2分别采用6配位形式，与之配位的四个氧配位原子分别出自于两个双齿螯合结构的羧基氧原子与两个水分子；与之配位的两个氮配位原子则分别出自两个配体联吡啶。

图3可看出，沿ac平面方向，单个配体(E)-二(对3-硝基苯甲酸)乙烯与两个Zn(Ⅱ)离子配位，而每个Zn(Ⅱ)离子还与一个水分子中氧配位原子和两个配体(E)-二(对3-硝基苯甲酸)乙烯配位，从而向外延伸构成2D平面。沿c轴方向，层和层间又经由联吡啶柱配体同Zn(Ⅱ)离子配位连接从而搭建3D网状结构，最终形成具有一维孔道结构的3D金属-有机框架材料(图3-4、图3-5、图3-6)。

图3 Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O次级构筑单元

图4 Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O 2D层结构

图5 Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O的三维结构图

图6 Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O的框架结构图

(二)Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O红外吸收谱图

图7 (E)-二(对3-硝基苯甲酸)乙烯配体(右)与Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O(左)的红外吸收谱图比较

(E)-二(对3-硝基苯甲酸)乙烯配体与Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O的红外吸收光谱如图7，其1598cm-1处吸收峰来自于苯环C=C震动，1500cm-1处吸收峰则属于-NO2基团的对称伸缩，1660cm-1处吸收峰则是c=c双键伸缩振动，810cm-1左右处吸收峰是吡啶环的C…H检形变振动，据此可证明配体(E)-二(对3-硝基苯甲酸)乙烯同配体联吡啶配位成功。

(三)显微镜与SEM表征Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O

利用显微镜和SEM，对Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O形貌进行表征。图8是Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O的显微镜图，可看出晶体Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O呈黄色菱形晶体。而图9是Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O 在SEM的表面形貌，可看出Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O表面结构呈鱼鳞状。

图8 Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O显微镜表征

图9 Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2OSEM表征

(四)荧光表征

Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O荧光发射光谱如图10。300nm波长激发时，Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O于383nm位置有一发射信号。

图10 Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O的荧光发射表征

(五)Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O粉末XRD表征

图11 Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O的粉末XRD表征

图11是Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O的实测和软件模拟及配体三者的粉末XRD结果。其中A图是配体联吡啶XRD，B图是配体(E)-二(对3-硝基苯甲酸)乙烯XRD，C图是Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O实测粉末XRD，D图则是Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O的模拟XRD。从图可看出，Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O实测值与软件模拟值能很好吻合，由此表明此化合物为纯相，且同两配体具有有明显差异。

(六)Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O热分析表征

在0℃到600℃温度范围氮气环境下对Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O进行了DSC-TG热重分析。图12是Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O的DSC-TG图。从图中可知，Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O可稳定至350℃。Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O在50-200℃温度范围发生第一次热失重，失重3.78%(理论值3.65%)，可归因于失去客体分子。而在350℃-560℃温度范围发生结构坍塌从而失重46.58%(理论值45.45%)，最终剩余物49.15%(理论值48.78%)主要成分ZnO。

图12 Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O的DSC-TG分析结果

(七)载药缓释研究

1.Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O载药量测定

通过测量发现洛贝林甲醇溶液最大吸收峰在 249 nm 处。

表2 给出了洛贝林与载体质量之比以及载药时间对Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O所载药物量之间的关系。可看出，随着洛贝林与载体质量之比的增加(固定载体质量，增加药物质量)，Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O载药量随之加大；作用时间的延长同样能使Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O载药量加大．但在不同药物与载体质量比之下，Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O最高载药量构出现于第5天，由此说明吸附作用在第5天时，Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O装载的药物量已经达到饱和，载药量到达最大值。而当作用时间延长到7天的时候，载药量反而有所下降，这有可能是吸附于Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O表面的部分药物由于浸泡时间过长而发生的脱落所导致，由此说明最佳的作用时间是5天。由表2 可知，最佳实验组条件为药物与载体质量比为5∶1，作用时间为5天，可得到的最高载药量为0.355 g/g载体。

表2 Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O(m1)装载洛贝林(m2)的载药量(n=3)

2.Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O装载洛贝林的体外释药

如图13所示，释药曲线的前半部分比较陡直，释药过程分为两个过程，最初的 12小时表现为突释的特性，洛贝林的突释量在12小时之内为29.2%，这主要是由于吸附于 Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O表面的洛贝林扩散进入介质而造成的，随后则进入平稳的缓慢释放阶段，吸附于Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O 孔道中的洛贝林慢慢被释放出来。平稳释放72小时内，洛贝林释放量达到 64.15%，而在平稳释放7天之内，洛贝林的释放量则达到75.23%，显示出明显的缓释效果。

图13 Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O装载洛贝林体外释药曲线

3.Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O 细胞毒性实验结果

本实验用正常生长细胞(Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O 质量浓度为0μg·mL-1) 做为阴性对照组，用Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O作为药物组，分别作用于Hela 细胞以此研究Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O的细胞体外毒性。细胞体外毒性实验结果显示，不同浓度的Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O 作用于Hela 细胞36小时之后，随Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O质量浓度的加大，细胞存活率呈现出下降趋势，当Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O质量浓度小于20μg·mL-1的时候，细胞存活率高，与对照组比较 P>0.05，而当Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O质量浓度大于20μg·mL-1的时候，细胞存活率随Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O 质量浓度的增大二下降趋势变得明显，在Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O质量浓度是250μg·mL-1时候，细胞存活率达到最低值。

综上，采用溶剂热法可经由配体(E)-二(对3-硝基苯甲酸)乙烯(C16H10N2O8)合成新型金属有机框架材料Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O；用干燥活化处理以后的Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O载入洛贝林，具有较高的载药量，释药曲线显示出Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O具有缓释功能，可延长洛贝林的作用时间，同时降低其副作用；而且Zn2(EBNB)2(BPY)2·2H2O具有良好的生物相容性，有望成为优良的药物载体。