鸡TIGAR基因真核表达质粒的构建及其抗凋亡功能评价

栗永华，车路平，仇旭升，谭磊，孙英杰，刘炜炜，宋翠萍，廖瑛，丁铲，王金泉，孟春春

（1新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052；2中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

0 引言

【研究意义】新城疫（newcastle disease，ND）是危害我国养禽业严重疫病之一，研究表明新城疫病毒（NDV）可诱导受感染细胞中 caspase依赖的内源性和外源性凋亡途径[1]，从而产生病变效应[2]。细胞凋亡的特征是细胞形态和生化变化，包括细胞膜泡、caspase活化和DNA断裂[3]。P53抑癌蛋白在细胞应激反应和抑制恶性发展中起着重要作用，P53抑癌蛋白通过协调 DNA修复、诱导细胞周期阻滞、凋亡、衰老和维持基因组稳定性等多种机制调节肿瘤细胞的增殖和侵袭力[4]，防止肿瘤的形成[5-8]。【前人研究进展】BENSAAD等提出p53在细胞代谢中起着直接作用，TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子（TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator，TIGAR）是p53下游的靶基因，具有调节糖酵解和抗氧化作用的蛋白[9]。在细胞中 TIGAR表达降低了果糖-2,6-二磷酸的水平来抑制磷酸果糖激酶(PFK)，进而有利于果糖-6-磷酸（fructose-6-phosphate，F-6-P）和葡萄糖-6-磷酸（glucose-6-phosphatase，G-6-P）的形成，从而抑制了糖酵解[5]。TIGAR可通过增加磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway, PPP）[10-12]，促进还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）的产生，从而去除活性氧（Reactive oxygen species，ROS）[13]，研究证实 ROS 在 p53 介导的细胞凋亡中有着重要调节作用，可以由多种途径抑制细胞生长、诱发细胞凋亡[14-15]、自噬[16-18]。YE等用RNA干扰沉默HepG 2细胞中的TIGAR mRNA后，主要通过细胞凋亡和自噬作用抑制细胞生长[19]。细胞内ROS水平的降低而导致细胞对p53以及其他与ROS相关凋亡信号的敏感性[11,20-21]。TIGAR可以在缺氧条件下与线粒体的己糖激酶2形成复合体，从而提高己糖激酶2的活性，降低线粒体膜电位，减少ROS产生，保护细胞免受ROS的损伤并保持线粒体的完整性[22-24]。KO等在研究中表明 TIGAR在乳腺癌细胞中的表达促进了肿瘤的代谢分化和线粒体的乳酸和谷氨酰胺分解代谢，是一种很有潜力的乳腺癌治疗方法[25]。【本研究切入点】前人已扩增出人、鼠、牛等动物的TIGAR基因，并研究TIGAR的抗凋亡及在肿瘤的发生、增殖和转移中发挥的重要作用。本研究首次从SPF鸡的脾脏中扩增出鸡的TIGAR基因，并研究了其抗凋亡的作用。【拟解决的关键问题】验证本研究扩增出的TIGAR是否具有抗凋亡功能，过表达 TIGAR基因后再感染病毒是否可以增加病毒滴度，并有利于病毒感染细胞的存活；为后续构建过表达TIGAR的细胞系和筛选适合新城疫病毒繁殖的高产细胞株提供前期基础。

1 材料与方法

试验于 2018年在中国农业科学院上海兽医研究所完成。

1.1 试验材料

限制性内切酶（EcoR I、BamH I）、Trizol、Alexa FlourTM 488 Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit为Thermo公司产品，Taq聚合酶、dNTP、T4DNA连接酶为诺唯赞公司产品，M-MLV、RNasin、FuGen为Promega公司产品，DH5α感受态细胞为天根公司产品，ECL发光液为圣尔公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 RT-PCR扩增TIGAR全长 取SPF鸡的脾脏，加PBS反复研磨3次，7 000 r/min离心10 min，取上清。采用Trizol裂解细胞提取RNA，加入随机引物 6nt和 Olig18t各 1 μL，70℃10 min，冰浴 5 min，按照 Promega公司试剂盒的操作方法逆转录为cDNA，反转录的温度为37℃ 2 h、42℃ 2 h，75℃ 5 min灭活。根据 GenBank（GenBank登录号：XM_417232.6）上预测的原鸡 TIGAR序列设计并合成上游引物（5′-CCGGAATTCATGGTTCGCTTCGGG CTGACC-3′，限制性内切酶为EcoR I）和下游引物（5′-CGCG GATCCGAACATTTTCGGAGCTACACA TTCAGCACC-3′，限制性内切酶为BamH I），以 cDNA为模板利用PCR扩增出鸡TIGAR的CDS区（扩增程序：95℃ 预变性30 s，95℃变性10 s，62℃退火30 s，72℃延伸1 min进行30个循环，72℃延伸10 min）。PCR结束后，产物经 1%琼脂糖凝胶电泳并在紫外灯下观察，用胶回收试剂盒收集PCR产物，并送至上海生物工程公司测序。

1.2.2 绘制哺乳动物、水生动物的TIGAR基因进化树TIGAR基因位于12号染色体短臂1区3带3亚带，含6个可能编码外显子的区域和2个P53结合位点[9,26-27]，BENSAAD发现在脊椎动物中（从鱼到人）高度保守[9]。利用GenBank上找到脊椎动物的TIGAR基因以及本研究扩增的TIGAR基因构建进化树。

1.2.3 质粒转染DF1细胞 在200 μL的Opti-MEM转染试剂中加入6 μL FuGen，室温静置5 min，再加入Flag-TIGAR或Flag-CMV14 2 μg，轻轻混匀，室温静置20 min后加入6孔板中，于37℃培养4—6 h，更换成10%DMEM继续培养。

1.2.4 TIGAR蛋白表达检测和PARP检测 将细胞接种至6孔板（细胞密度为1×105），待细胞长至70%时转染 2 μg重组质粒（Flag-TIGAR）和空载体（Flag-CMV14），转染24 h后感染Herts33（1MOI），在感染后18、24、30、36 h收集样品，每孔加入200 μL 2×Loading Buffer裂解细胞，收集入离心管，100℃煮样10 min，12 000 r/min离心3 min。取等量样品上样于10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电转移至硝酸纤维素膜上，加入5%脱脂乳室温封闭2 h；按照1:1 000稀释一抗（Flag、NP、PARP）4℃封闭过夜，用TBST洗膜3次，每次10 min；按照1:5 000稀释二抗室温封闭1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。用化学发光法显色。

1.2.5 流式检测细胞凋亡 将细胞接种至6孔板（细胞密度为1×105），待细胞长至70%时分别转染重组质粒（Flag-TIGAR）和空载体（Flag-CMV14），转染后24、48 h收集细胞，用PBS洗后，加500 μL不含EDTA的胰酶消化2 min，用PBS吹下细胞并收集入离心管中，4℃1 000 r/min离心5 min，弃上清，用预冷的PBS洗3次，加入500 μL 1×Binding Buffer重悬细胞，分别加入5 μL PI（用1×Binding Buffer做10倍稀释）、25 μL Annexin V-FITC，室温避光孵育15 min，用流式仪检测细胞凋亡情况。

2 结果

2.1 TIGAR的扩增及遗传进化分析

扩增的全长TIGAR基因经1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示扩增片段大小为 843 bp，与预期结果相符（图1）。

本研究扩增的TIGAR基因全长3 206 bp，CDS区843 bp编码281个氨基酸，已上传至GenBank并获得登录号（MH511993.1），将扩增的鸡TIGAR基因的序列与其他脊椎动物的TIGAR基因的序列进行比对并构建进化树（图2），发现TIGAR基因在脊椎动物中高度保守。

图1 RT-PCR扩增鸡TIGAR基因Fig. 1 Amplification chicken TIGAR gene with RT-PCR

2.2 Flag-TIGAR真核质粒的鉴定

将Flag-TIGAR重组质粒和空载转染至DF1细胞系中，转染后24、36、48 h的样品利用Western Blot检测蛋白表达情况，结果显示转染重组质粒的样品在30 kD的位置出现了条带，大小与预期结果一致；转染空载体（Flag-CMV14）和未转染细胞的样品未出现条带，表明Flag-TIGAR重组质粒构建成功（图3）。

2.3 Western Blot检测PARP

将Flag-TIGAR重组质粒和空载转染至DF1细胞系中，转染后 24 h 感染 Herts/33（1MOI），Western Blot检测NP、FLAG、PARP的表达情况，结果显示转染重组质粒的样品均表达TIGAR；感染组均表达NP；在30 h、36 h的样品中PARP均有裂解条带且转染重组质粒（Flag-TIGAR）的样品裂解出PARP的表达量明显低于未转染质粒（MOCK）组的样品，且差异极显著（P＜0.01）（图4）。

图2 哺乳动物、水生动物的TIGAR基因的进化树Fig. 2 Phylogenetic tree of TIGAR gene in mammals and aquatic animals

2.4 FCM检测转染TIGAR对细胞凋亡的影响

将Flag-TIGAR和Flag-CMV14转染入DF1细胞，在转染后24、48 h收集细胞用流式细胞仪检测细胞凋亡情况（收集样品前2 h用药物Staurosporine诱导细胞凋亡，按照1：1 000的比例使用）。结果显示，24 h转染Flag-CMV14后细胞总凋亡率为11%（早期凋亡7.8%，晚期凋亡3.2%），而转染Flag-TIGAR后细胞总凋亡率为4%（早期凋亡3.7%，晚期凋亡0.3%），转染 Flag-CMV14的早期凋亡率和晚期凋亡率均高于转染 Flag-TIGAR组，且差异显著（P＜0.05）；48 h转染Flag-CMV14后细胞总凋亡率为20.3%（早期凋亡14.3%，晚期凋亡6.0%），而转染Flag-TIGAR后细胞总凋亡率为6.4%（早期凋亡4.8%，晚期凋亡1.6%），转染 Flag-CMV14的早期凋亡率和晚期凋亡率均高于转染Flag-TIGAR组，且差异极显著（P＜0.01）（图5）。

图3 Flag-TIGAR真核质粒表达(Flag抗体)Fig. 3 Expression of Flag-TIGAR with Western Blot（Flag antibody）

图4 Western Blot检测PARP表达Fig. 4 Detection PARP expression with Western Blot

3 讨论

TIGAR是具有调节糖酵解和抗氧化作用的蛋白，是存在于机体内的p53基因诱导的糖酵解和凋亡调节因子，通过抑制糖酵解途径，增加磷酸戊糖途径（PPP），可产生大量的5-磷酸核糖，是DNA修复和合成的重要原料[26]；还可以通过维持还原型谷胱甘肽所需的 NADPH水平来调节 ROS水平，保护细胞免受ROS的损伤并保持线粒体的完整性，细胞内NADPH升高，活性氧（ROS）和自噬活性降低，因此 TIGAR既可以抑制细胞凋亡又抑制自噬[21, 28]。

本试验利用鸡脾脏组织cDNA为模板扩增出鸡的TIGAR基因，经测序分析后，并将TIGAR基因序列上传至GenBank。本研究通过检测凋亡蛋白（PARP）以及流式检测，结果表明扩增的鸡 TIGAR基因具有抗凋亡的功能。

图5 FCM检测细胞凋亡率Fig. 5 Detection the rate of apoptosis with FCM

研究表明TIGAR在抗细胞凋亡及在肿瘤的发生、增殖和转移中发挥的重要作用。周骏浩通过试验预测 TIGAR在脑预适应中的作用可能是中风预防和治疗[29]。细胞自噬是真核细胞内维持细胞自稳态的正常的分解代谢活动， 通过溶酶体将长寿蛋白、损伤的细胞器以及外源病原微生物吞噬、降解的过程,是机体内一种重要的保护和防御机制。冯婧等干扰TIGAR蛋白后，细胞色素c在胞质内含量明显增加而在线粒体内含量减少，且干扰组细胞凋亡率明显升高，表明细胞凋亡增加；并检测细胞中自噬标志蛋白LC3-II/LC3-I、Beclin1表达显著上升，同时P62表达下降，表明细胞自噬增强[30]。细胞发生凋亡后不利于病毒在细胞内的复制[31-33]，所以本研究为建立一株抑制病毒凋亡和自噬，利于病毒复制的细胞系奠定了前期基础。

4 结论

首次扩增出鸡的 TIGAR基因，并对其功能进行研究，确认其具有抗凋亡的作用。为进一步研究鸡TIGAR基因在减少细胞凋亡，促进细胞增殖能力方面的研究提供了借鉴。

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