无线粒体DNA的人肺腺癌A549细胞系的构建

李素芬，郝西琳，王唯斯，严长宝，赵妤，余敏，熊伟

1.大理大学 基础医学院，云南 大理671000；2.大理白族自治州第一人民医院 病理科，云南 大理671000；3.云南大学 生命科学学院，云南 昆明530061

线粒体是所有真核细胞的“动力工厂”，其主要功能是通过氧化磷酸化为细胞提供ATP，同时也参与物质代谢、细胞增殖、细胞凋亡和细胞衰老等过程[1]。研究发现，线粒体呼吸链功能缺陷能够累及机体的能量代谢、神经传递、内环境平衡等，进而促进人类多种疾病的发生，如线粒体脑肌病、线粒体糖尿病、Leber遗传性视神经病变、耳聋、心肌病、恶性肿瘤及衰老等，统称为线粒体相关疾病[2]。研究线粒体呼吸链缺陷发生的分子遗传机制，可以进一步阐明线粒体相关疾病的病因并为临床治疗提供指导[3]。为了实现上述目的，需要建立一个特殊的细胞模型，它不含线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA），使我们能够将患者体细胞或生殖细胞内的mtDNA从一个细胞环境转移到另一个细胞环境，或者将新的外源DNA引入线粒体，从而阐明线粒体基因突变或缺失在呼吸链功能缺陷中的作用及分子机制[4]。通常，人们将mtDNA缺失的细胞系称为Rho0（ρ0）细胞系。我们以稳定传代的人肺腺癌A549细胞系为母本细胞，用低剂量溴化乙锭（ethidium bro⁃mide，EB）持续处理该细胞系，诱导mtDNA缺失，试图建立ρ0A549细胞系。

1 材料与方法

1.1 材料

人肺腺癌A549细胞系由瑞典卡罗琳斯卡医学院实验医学系Anna Karlsson教授惠赠。

RPMI1640培养基、透析/普通胎牛血清（FBS）购自Gibco公司；EB、丙酮酸钠、尿嘧啶核苷、苯甲基磺酰氟（phenylmethane sulfonyfluoride，PMSF）等生化试剂购自Sigma公司；动物细胞基因组DNA快速提取试剂盒购自Qiagen公司；细胞裂解液、聚丙烯酰胺（PAGE）预制凝胶、4×蛋白质上样缓冲液购自Invitrogen公司；MTT细胞增殖检测试剂盒购自Roche公司；TaqMan Real-time PCR Mas⁃ter Mixes购自Thermo Fisher公司；增强型化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）试剂盒、聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜购自Millipore公司；二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA）法蛋白质定量试剂盒购自Pierce公司；兔抗MT-COX1单抗（ab203912）、兔抗MT-ATP6多抗（ab192423）、兔抗SDHA单抗（ab137040）、兔抗ATP5A单 抗（ab176569）、兔 抗GAPDH单 抗（ab181602）、HRP标记的山羊抗兔IgG（ab6721）购自Abcam公司；qPCR引物和探针由昆明硕擎生物科技有限公司合成。

生物安全柜（苏州净化设备有限公司）；全自动高压灭菌锅（上海博讯实业有限公司）；倒置显微镜（Olympus公司）；QuantStudio 7 Flex实时荧光定量PCR系统、全自动细胞计数仪（Life Tech公司）；CO2培养箱、Nanodrop ND1000核酸和蛋白质定量仪、MK3型全自动酶标仪（Thermo Fisher公司）；蛋白质电泳仪、Trans-Blot Turbo蛋白质转印仪（Bio-Rad公司）；G:BOX F3化学发光及凝胶成像系统（Syngene公司）；BL150S型电子天平（Sartorius公司）；微量移液器（Biohit公司）。

1.2 构建无mtDNA的ρ0A549细胞系

按照文献报道的方法[5]，将人肺腺癌ρ+A549细胞培养于含50 ng/mL EB、50μg/mL尿嘧啶核苷和100μg/mL丙酮酸钠的RPMI1640完全培养基（含15%透析FBS）中，于37℃、5% CO2培养箱中培养，每2～3 d更换一次培养液，每周传代2次。连续培养35 d后，将细胞培养液换成含50 μg/mL尿嘧啶核苷、100μg/mL丙酮酸钠、15%透析FBS的RPMI1640培养基继续培养。

1.3 相对荧光定量PCR（qPCR）检测mtDNA拷贝数

收集处于对数生长期的野生型ρ+A549和ρ0A549细胞，用基因组DNA提取试剂盒提取细胞内总DNA。参照文献方法[6]，采用TaqMan探针法进行qPCR，以细胞核编码APP基因为内参照基因，扩增线粒体基因组D-loop区来检测mtDNA拷贝数的变化，引物序列和探针序列见表1。实验重复3次。

1.4 Western印迹检测蛋白质表达水平

收集处于对数生长期的野生型ρ+A549和ρ0A549细胞，加入细胞裂解液提取总蛋白，采用BCA法测定各组的蛋白质浓度[7]。每个泳道分别加入50μg蛋白质样品，行12% SDS-PAGE，电泳分离后将凝胶上的蛋白质用半干转印法（20 V，7 min）转移至PVDF膜上；将PVDF膜用含5%脱脂奶粉的PBST于室温封闭1 h，分别滴加一抗（1∶1000稀释），4℃孵育过夜；用PBST洗膜3次，每次5 min，洗膜结束后滴加相应的二抗（1∶5000稀释），室温孵育2 h；用PBST再次洗膜3次，每次5 min；用ECL发光液显影并采集图像。用Image Lab 5.2.1软件分析各条带累积光密度值（integral optical density，IOD），统计2组细胞中蛋白质相对表达量。实验重复3次。

1.5 MTT法测定细胞增殖曲线

收集处于对数生长期的野生型ρ+A549和ρ0A549细胞，其中ρ0A549细胞用含100μg/mL丙酮酸钠、50μg/mL尿嘧啶核苷、10% FBS的RPMI 1640培养基培养。将2组细胞分别制成单细胞悬液并计数，调整细胞浓度为2×104/mL，96孔板中每孔加入100μL细胞悬液，即每孔2000个细胞，放入CO2培养箱中培养。待细胞贴壁，培养24、48、72、96、120 h后，每孔加入20μL MTT溶液（5 mg/mL）后继续培养4 h，小心吸弃培养液后，每孔加入150μL二甲基亚砜溶解结晶，于摇床上低速振荡15 min，待结晶物充分溶解后，用酶标仪测定各孔的D570nm值。实验重复3次。

表1 荧光定量PCR引物和探针序列

1.6 统计学分析

运用SPSS 21.0和Graphpad Prism 5.0软件进行统计学分析和绘图，计量资料结果以x±s表示，2组间均数比较采用独立样本Student'st检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ρ0A549细胞的形态学鉴定

普通倒置显微镜下观察，低剂量EB诱导35 d后，ρ0A549细胞形态发生明显变化，呈拉长枝状，长径与短径比值大于5；而未经EB诱导的野生型ρ+A549细胞呈多角形，长径与短径比值小于5（图1）。且ρ0A549细胞生长速度明显慢于野生型ρ+A549细胞，野生型ρ+A549细胞传代时间为2～3 d，ρ0A549细胞传代时间为5 d，符合肿瘤失去有氧代谢途径后在低氧下生长的一般规律。

2.2 qPCR检测结果

以细胞核基因组（nDNA）APP基因为内参照，扩增mtDNA的D-loop区。qPCR结果显 示，野 生型ρ+A549细胞中可以检测到mtDNA的拷贝数，经低剂量EB连续诱导35 d的ρ0A549细胞中已无mtDNA的存在（图2）。

2.3 Western印迹检测结果

图1 倒置显微镜下观察A549和ρ0 A549细胞的形态

Western印迹结果显示，野生型ρ+A549细胞中能表达核基因编码的线粒体蛋白SDHA和ATP5A，同时也能表达线粒体基因组编码的蛋白MT-COXI和MT-ATP6；ρ0A549细胞中无线粒体基因组编码的蛋白MT-COXI和MT-ATP6的表达，但核基因编码的SDHA和ATP5A蛋白均能够正常表达（图3）。

2.4 细胞生长曲线

在RPMI1640完全培养基中培养野生型ρ+A549细胞，在含有尿嘧啶和丙酮酸的RPMI1640完全培养基中培养ρ0A549细胞，MTT法检测2组细胞的增殖力并绘制生长曲线。结果表明，与野生型ρ+A549细胞相比，ρ0A549细胞在24、48、72、96、120 h各时间点的生长速度均明显减慢，2组间差异有统计学意义（P＜0.05）（图4）。

3 讨论

人类mtDNA为双链闭环DNA分子，长16 569 bp，一个细胞内常含有多个拷贝的mtDNA分子，且野生型和突变型往往同时存在[8]。mtDNA含有37个基因，分别编码13个呼吸链多肽、22个tRNA和2个rRNA，此外有1个含基因复制和转录调控序列的非编码区D-loop[8]。mtDNA与细胞癌变、肿瘤发生之间的关系已成为人类癌症研究的热点之一。目前，在许多不同类型的实体瘤中均发现了mtDNA拷贝数发生改变的现象[9]，而且mtDNA拷贝数的改变还与临床病理参数和肿瘤的侵袭性有关[10]。有研究发现，在人肺腺癌A549细胞中，由于mtDNA拷贝数的减少而诱导的线粒体压力引起了细胞表型的改变，显著影响了肿瘤的增长和肿瘤的侵袭性，并且ρ0A549细胞较ρ+A549细胞的放射敏感性降低[11]。这些结果提示，mtDNA拷贝数的减少与线粒体氧化磷酸化复合物的下降密切相关，进而导致肿瘤细胞出现异常的能量代谢与物质代谢。

图2 qPCR检测A549和ρ0 A549细胞mtDNA拷贝数

图3 Western印迹检测ρ0 A549细胞核编码蛋白质和线粒体编码蛋白质

图4 MTT检测ρ0 A549细胞生长曲线（*P＜0.05）

已有研究表明，用低剂量EB处理肿瘤细胞可建立无mtDNA的肿瘤细胞系[12]。因为EB是一种DNA分子螯合剂，可以插入无组蛋白保护的mtDNA分子碱基内部，并显著抑制DNA聚合酶γ在mtDNA复制过程中的活性[13]。细胞培养基中低剂量的EB即可导致人类细胞内的mtDNA分子完全缺失，导致细胞内存在线粒体但无mtDNA。mtDNA的缺失使线粒体基因组编码的呼吸链必需的蛋白质缺失而导致呼吸链功能受损，细胞只能通过ATP/ADP转位酶、糖酵解途径产生的能量来维持生长需要。同时，由于线粒体电子链完整性受到破坏，波及到参与嘧啶合成的二氢乳氢酸脱氢酶活性，影响嘧啶核苷酸的生物合成，因而加入外源性的尿嘧啶核苷是无mtDNA的人类细胞系生长所必需的[14]。我们在本研究中发现，以100 ng/mL EB诱导培养人肺腺癌A549细胞，能够进行性降低细胞mtDNA拷贝数。研究中还发现，如果诱导7 d后撤除EB，mtDNA拷贝数会逐渐恢复。用EB连续诱导培养35 d的ρ0A549细胞则能逐渐形成较低水平的mtDNA拷贝数直到mtDNA完全缺失。这些结果强烈提示，EB诱导的人肺腺癌A549细胞内mtDNA缺失是一个长期积累的过程。PCR法是鉴定mtDNA缺失的常规方法之一，本研究通过qPCR检测mtDNA扩增情况和mtDNA拷贝数，证实ρ0A549细胞中mtDNA的缺失。同时，Western印迹也表明，ρ0A549细胞不能表达线粒体基因组编码的蛋白质，但是能够正常表达核基因编码的线粒体蛋白质。以上结果从分子水平上证实无mtDNA的ρ0A549细胞系已经构建成功。MTT细胞增殖实验结果表明，与野生型ρ+A549细胞相比，ρ0A549细胞在不同时间点的生长速度均明显减慢，提示ρ0A549细胞已无法通过线粒体氧化磷酸化产生ATP，而主要依靠糖酵解来供能维持细胞生长。

mtDNA突变与人肺腺癌发生关系密切[15-16]。由于ρ0A549细胞中缺乏内源mtDNA，可以通过细胞融合技术构建各种胞质杂交融合细胞（cy⁃brid），建立肺腺癌线粒体基因突变模型，并且有效排除核基因的干扰。在后续研究中，我们将进一步构建转线粒体细胞系，研究相同核遗传背景下，不同mtDNA分子的基因突变及功能变化，为人肺腺癌发生和mtDNA突变的相关性研究奠定基础。

志谢：衷心感谢瑞典卡罗琳斯卡医学院实验医学系周小山研究员、赵茜博士提供的实验技术指导和对文稿写作的建议。