食品中耐药细菌风险评估的研究进展

姜竹茂，艾春梅,，王晔茹，董庆利，刘东红，丁 甜,*

（1.烟台大学生命科学学院，山东 烟台 264005；2.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310058；3.国家食品安全风险评估中心，北京 100022；4.上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093）

抗生素的使用是现代医疗卫生的基础之一，可以有效抑制细菌的增长或者杀死细菌，被广泛应用于人类疾病治疗及农业、畜牧业、水产养殖等领域，但由于抗生素的不合理使用，现已产生严重的抗生素耐药性问题[1]。2014年世界卫生组织发布了全球耐药性报告——《抗菌素耐药：全球监测报告》，该报告首次审视了全球抗生素耐药情况，提出当抗生素药物治疗被感染人群不再有效时，即为抗生素耐药。2016年9月联合国193 个成员国签署了一份历史性宣言，承诺合作扫除“超级病菌”对人类健康的威胁，这份宣言一旦落实，每年可以避免70万 人死亡[2]。所谓的“超级细菌”是指那些对多种抗生素具有耐药性的细菌，即多重耐药细菌[3]。有专家称这种“超级细菌”对抗生素有强大的抵抗作用，能避免被灭活[4]。

经研究，细菌先天具有耐药性和染色体突变性，可以通过多种机制（质粒、转座子、整合子、基因盒等）来获得并传播耐药基因[5]。当使用抗生素时，由于细胞膜通透性改变、靶标位点突变及钝化酶等原因而产生耐药细菌，并通过水平基因转移（horizontal gene transfer，HGT）机制传播耐药细菌和耐药基因（图1）[6-8]。食物链是一个众多细菌共存的生态系统，长期在抗生素选择压力下，食品在整个食物链过程中会发生耐药细菌污染或耐药基因的转移，如动物源耐药细菌可通过动物的排泄物、环境、空气及水等途径，或者在食品加工过程产生的交叉污染等，将耐药细菌或耐药基因传递给人类，使人类产生人源性耐药细菌[9]。

图 1 细菌主要耐药机制[7]Fig. 1 Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria[7]

图 2 食品中的HGT机制[16]Fig. 2 Horizontal gene transfer mechanism in foods[16]

如图2所示，HGT是不同物种之间通过水平转移方式进行遗传物质的传递。通过不断改造和进化[10]，提升物种的适应能力，这是生物进化的重要驱动之一[11]。HGT在细菌间的作用机制主要有偶联、转化和转导3 种，这种作用机制可能发生在土壤、水、食物以及人类和动物的消化系统中[12]。有专家提出若HGT和细菌耐药机制相结合，会大大增强耐药基因的表达、维持细菌种群以及多重耐药性的产生[13-15]。

近年来，针对耐药细菌的传播及耐药基因的转移研究较多，结果都显示其对人类健康可造成潜在危害。Fang Hua等[17]采用宏基因组学分析方法，探讨了耐药基因（antibiotic resistance genes，ARGs）、人类致病菌（human pathogenic bacteria，HPB）和抗生素耐药HPB（antibiotic resistant HPB，ARHPB）从养猪场向周围河流及农业土壤环境的传播情况，结果发现动物饲养场周围的河流沉积物、河水以及土壤中都存在有耐药基因、HPB及ARHPB。在216 株耐药细菌分离株中有54.4%是潜在的ARHPB，并有4 株多重耐药基因-HPB分离株。因此，HGT机制已被确定为耐药基因传播的主要途径之一，由于耐药基因可通过HGT转移，动物体内微生物组中的耐药基因向人类体内转移的情况时常发生。Apata等[18]提出HGT和垂直基因转移这两种类型机制的共同作用使得耐药细菌的数量和传播风险大幅增加[19]。

因此，开展食品中耐药细菌风险评估、权衡风险和利益、科学管理和使用抗生素，可以有效地保障食品安全和人类健康[4]。在耐药细菌风险评估领域，瑞士和丹麦等欧洲国家一直走在前列。早在2004年，Claycamp等[20]基于传统微生物风险评估理论探讨了耐药细菌的风险评估方法，运用危害识别、释放评估、暴露评估、剂量-反应关系评估、风险评估5 个步骤，描述了食品生产链中耐药细菌对人类健康造成的不良后果。同时，该报告指出，与传统微生物风险评估方法相比，由于耐药细菌风险评估中存在数据缺乏和模型不确定性等问题，将来对可靠模型创建和监测的数据需求依旧保持不变。本文根据食用动物产品生产中抗生素耐药细菌风险评估的组成部分及路径（图3）[21]，综述了食品中耐药细菌风险评估的最新研究进展及其预防控制措施，以期为未来耐药细菌风险评估研究提供理论依据。

1 危害识别

由图3可知，危害识别的目的是识别可能导致人类疾病的耐药细菌或耐药基因。在《食用动物中使用抗菌兽药产品对公众健康造成耐药性风险评估指南》中指出，在整个危害识别过程中，需要考虑的几个因素是：1）物质特定信息（抗菌类别、作用机制等）；2）识别治疗目标物种中对人类健康造成影响的耐药细菌；3）产生细菌耐药性的决定因素和机制；4）交叉阻力因素；5）影响人类健康细菌的敏感性数据分析（最低抑菌浓度）。

图 3 食用动物生产中抗生素耐药性风险评估的组成部分及路径[21]Fig. 3 Components and pathways for risk assessment of antibiotic resistance in food animal production[21]

Alban等[22]在危害识别中发现丹麦病猪使用截短侧耳素会产生可向人类转移的肠球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌CC398（MRSA CC398），这两种耐药细菌可能是由转座子和质粒所介导的染色体或可动遗传因子经HGT机制在不同菌种之间传播。然而，在许多分析中由于数据缺乏以及缺少对耐药机制的监测分析，很多耐药细菌在危害识别中未被考虑在内。

然而，与传统的微生物风险评估相比，在危害识别阶段很难准确估计耐药细菌对人类健康的影响程度，只有当抗生素对患者治疗不再有效时才能准确估计。在水产养殖、牲畜饲养、作物栽培及食品生产等整个食物链中，耐药细菌/耐药基因都可能会通过包括抗生素、抗病毒药物、杀真菌剂等压力选择，最终利用HGT机制进入人或动物体内[23-25]；其也有可能是人类或动物暴露于消毒剂或生物杀灭剂中，从而导致耐药细菌的出现[26-27]。因此，在这一系列复杂的过程中，人类可通过直接接触或者间接接触的方式使耐药细菌转移并蓄积于人体内。由此可见，对抗生素的监测及耐药细菌患病率的估计是非常重要的。赵勇等[28]总结了食源性致病菌主要的耐药机制；Florez-Cuadrado等[9]介绍了耐药细菌的选择和传播方法；Founou等[29]总结了发达国家和发展中国家从食用动物和产品中分离的耐药细菌引起的人类患病率。这些研究为耐药细菌的风险识别提供了理论依据。

2 释放评估

释放评估描述了在目标物种中使用抗生素后向特定环境释放耐药细菌或耐药基因所必经的生物途径，并定性或定量评估全过程发生的概率，包括目标物种在屠宰、加工以及处理人员对物种的直接接触等一系列过程中释放耐药细菌的可能性（图3）。Singer等[30]描述了由于使用抗生素治疗泌乳奶牛的临床乳腺炎，产生耐药细菌并在操作过程中释放的可能性。运用定量方法在每个节点采用蒙特卡罗（Monte Carlo）模型模拟：第1节点估计患有临床乳腺炎的哺乳期奶牛接受抗菌治疗的病例数，根据其病例情况将患病奶牛分为轻度、中度和重度[31]，中度至重度临床乳腺炎的奶牛给予拭药（intramammary，IMM）和注射用药治疗，估计用IMM治疗病例数占90.25%，利用IMM和注射用药治疗病例数占93.25%；第2节点估计抗生素使用后耐药细菌出现的可能性，包括奶牛中每种细菌病原体引起的患病率、每种病原体对每种抗生素的敏感性以及在使用抗生素后每种病原体中耐药细菌产生的可能性；第3节点估计被送往屠宰的奶牛中所携带的耐药细菌离开农场的可能性。

Alban等[22]在释放评估中运用定性评估对丹麦猪群进行了调查，结果显示肠球菌在猪肠道微生物群中较多，且环境中也无处不在，因此推测猪体内可能会存在肠球菌。经调查，2015年发现丹麦猪因粪肠球菌患病的概率为24.7%；对水貂养殖场研究发现在39 株MRSA CC398菌株中，79.5%的菌株对泰妙菌素有耐药性；经丹麦当地搜集的数据发现，MRSA CC398分离株通常对四环素（100%）和克林霉素（87%）具有抗性，对红霉素具有高水平的抗性（43%）。因此，评估丹麦猪群中MRSA CC398释放的总体概率高（中度不确定性），而肠球菌释放的总体概率低（高度不确定性）。

因此，在释放评估中需要考虑的因素可能有：1）目标物种的品种、生产饲养形式和疾病迹象，以及动物与饲养场间及周围（植物产品和水产养殖）耐药细菌传播的可能性；2）抗生素的使用剂量和使用期限等，以及给药途径过程中可能与其他抗生素的协同/交叉耐药性；3）耐药基因在目标物体内和体外发生HGT的频率；4）抗生素在建议条件下使用时，目标物种中的食源性致病细菌及耐药细菌的致死情况；5）在目标动物群体中人畜共患病菌的携带率和产生耐药细菌的概率等；6）目标物种在屠宰加工过程中人为地直接或间接接触导致耐药细菌传播和转移的可能性等。过去研究人员试图量化抗生素治疗食用动物耐药细菌释放的可能性，其风险管理可能会提高释放评估的便利性[32]。

3 暴露评估

暴露评估描述了人类暴露于耐药细菌，或在动物中使用某种抗生素释放耐药细菌或耐药基因所必经的生物途径，并用定性或定量法估计其暴露发生的概率（图3）。人类可直接或间接接触沿食物链传播的耐药细菌。直接接触是人类直接接触动物和生物物质（如血液、尿液、粪便、牛奶、唾液和精液）之后，耐药细菌在宿主之间迅速传播（图4），相关职业人员如兽医、农民、屠宰工人和食品加工人员以及与他们直接接触的人都可能被耐药细菌直接感染，并且感染的可能性会更高[33-34]。另外，人类可能通过接触或食用受污染的食品（例如肉、蛋、奶和乳制品）而间接接触到耐药细菌和耐药基因。通过食物链间接接触传播是一种影响深远且更复杂的途径，因为在整个食物链中无论是在肉类、蔬菜还是粮食生产的不同阶段，耐药细菌或耐药基因都会在牧场、环境及人类之间传播[35-37]。

图 4 食物链中耐药细菌的不同传播途径[16]Fig. 4 Different routes of transmission of drug-resistant bacteria in food chains[16]

在暴露评估阶段，Singer等[30]采用定量事件树模型中的3 个节点，利用蒙特卡罗模型模拟评估人类通过屠宰奶牛以及食用受污染牛肉而暴露于耐药细菌的可能性：首先，评估使用抗生素的奶牛在屠宰前产生耐药细菌（沙门氏菌、大肠杆菌和弯曲杆菌）的可能性；其次，对使用抗生素治疗后携有耐药细菌的奶牛屠宰数量进行估计；最后，估量经不同加工切割方式销售的牛肉产品引起人类受食源性耐药细菌污染的可能性。

Alban等[22]在此阶段定性分析了人类通过肉类接触到MRSA CC398和肠球菌的可能性，比如职业人员与牲畜直接接触或通过环境、土壤、人等间接接触等。兽医、猪运输者和与活体动物接触的屠宰场工作人员与耐药细菌接触的可能性更高[38]。2014年，丹麦人口为570万，雇用的劳动力有270万，因此估计其中有11 000～15 000 人是MRSA CC398的携带者，约占工作人口的0.4%～0.5%和总人口的0.2%～0.3%，而通过与环境、土壤或作物间接接触污染的概率被评估为低或未知；对于肠球菌，通过食源性途径传播的重要性是未知的，属于高不确定性[22]。

类似地，在暴露评估中需要考虑：1）人类对食物的消费及消耗方式；2）食用受细菌污染食物的情况；3）抗生素耐药细菌的流行情况；4）人类通过直接或间接接触动物而获得耐药细菌的情况。因此，在暴露评估中人为的驱动可能是暴露途径的开始，除了释放评估中的监管风险管理，在食品的生产加工过程中相关数据的搜集也很重要；也可在其中寻找耐药细菌释放的途径，并揭示人类耐药细菌的来源，如食物制备过程中耐药细菌的传播等；另外，公共卫生检查和数据监测也可用于更新风险评估模型的暴露评估部分，这都为风险评估建模提供了便利性。

4 剂量-反应关系评估

要正确表征抗生素耐药细菌的致病风险，典型的方法是选择有剂量-反应健康数据（无论是确定或推测）的危害因素。剂量-反应评估包括被摄入的病原体（剂量）和发生不良后果的可能性之间的关系[39]。也就是说在不同的暴露水平下会有不同的患病结果[40]。一般的耐药性剂量-反应关系研究方法是建立QMRA模型。如Claycamp等[20]提到平均感染剂量，并表明在动物或人类临床研究或人类流行病学中获得的剂量-反应关系是定量风险评估的基础，用于评估暴露人群感染耐药细菌的后果及其风险。在定量评估中除了利用QMRA模型之外，早期是根据生态学或病例对照流行病学方法（比率法）实现的。Anderson等[32]的研究中运用生态学方法来构建风险评估的概率模型，对动物中耐氟喹诺酮的空肠弯曲菌进行风险评估。

5 风险评估

风险评估综合评估了人类暴露于危险中的潜在后果（不良健康影响）以及后果发生的严重性和可能性（图3）。它涉及到特定情况下暴露的耐药细菌或耐药基因与这些暴露后果之间的关系，及其可能导致的社会经济后果。风险评估综合了释放评估、暴露评估、剂量-反应关系评估的结果，以全面描述相关风险及其伴随的不确定性；在此过程中，对任何可能影响最终风险评估的假设和不确定性，或者可能存在的后果，都应予以评估[16]，如：1）每年由耐药细菌感染人类的病例数（未报告的病例数）；2）感染疾病的严重程度，包括死亡、并发症的产生、患病时间和住院时间（额外治疗）等；3）耐药细菌与敏感生物的毒性比较；4）抗菌药物治疗的费用；5）亚种人群的易感性等。

在Alban等[22]的研究中，2015年丹麦由MRSA CC398引起的临床感染患者因产生更多的并发症，出现住院时间延长、花费增加等现象，估计重度患者每人平均花费高达27 000 欧元。其次，截短侧耳素的大量使用会引起公共卫生负担和患病人数增加等问题，研究结果显示：人体携带MRSA CC398和尿路感染肠球菌（肠球菌菌株）的情况是相当常见的，而MRSA CC398的严重感染很少发生，肠球菌的严重感染主要与住院时间延长有关。截短侧耳素在丹麦不用于人类，供人类使用的利奈唑胺仅在特定的医院环境和选定的患者组中使用。因此，MRSA CC398的后果评估中，被评估为正常群体的概率非常低，但被评估为弱势群体的概率较高。

Singer等[30]使用定量风险评估方法估计了由牛肉中所携带的耐药细菌引起人类疾病的病例数，同时评估因食用IMM和拭药治疗的不同治疗方法的牛肉产品引起人类感染耐药细菌的病例数。结果显示：经头孢噻呋注射治疗牛乳腺炎疾病，由于耐药细菌的产生，人类平均每年因感染沙门氏菌持续出现症状的概率是1/25 369百万，因感染大肠杆菌持续出现症状的概率是1/918 236百万；经头孢噻呋注射治疗和IMM相结合治疗牛乳腺炎疾病，由于耐药细菌的产生，人类平均每年因感染沙门氏菌持续出现症状的概率是1/6 698百万，因感染大肠杆菌持续出现症状的概率是1/243 227百万；经头氧四环素药物注射治疗，由于耐药细菌的产生，人类平均每年因感染弯曲杆菌持续出现症状的概率是1/225 903百万，因感染沙门氏菌持续出现症状的概率是1/26 908百万，因感染大肠杆菌持续出现症状的概率是1/14 567 063百万。

6 发展现状及前景

近几年，国内外对食物链中耐药细菌风险评估的研究甚少，但有一些关于耐药细菌风险评估分析及总结性文章。如Nicholas等[41]提到耐药细菌的风险评估因数据有限，可以从其他路径和可能的实验方法来填补其数据空白，包括：食物链农场环境阶段最小选择浓度的确定、剂量-反应数据的确定、筛选新的耐药决定因子、基于暴露评估模型建立风险排序方法等，都可为食物链中抗生素耐药细菌的风险评估提供指导。Stella等[42]提出，根据“一体健康”方针，欧洲食品安全管理局、欧洲疾病控制中心和欧洲药品管理局等其他欧盟机构应密切合作，提供科学指导和技术咨询，收集和分析人类和动物中耐药细菌监测数据并联合评估，同时欧洲食品安全管理局还应就食品安全议题进行风险交流，使整个食物链中的所有相关部门都参与进来，制定以科学为基础的战略来减少抗生素耐药细菌对人类健康造成的危害。

6.1 风险等级排序

在可用于控制公共卫生危害资源有限的背景下，鉴于耐药细菌的复杂性和广泛性，将确定的动物物种、细菌种类和/或抗生素抗菌类别等应用于未来风险管理活动至关重要。Colliineau等[43]利用瑞士耐药细菌监测计划的数据，将208 种动物/细菌/抗菌类别组合确定为相关危害，使用多标准决策分析开发并组合暴露评估和危害特征评分，通过敏感性分析探索改变分数权重。由于烹饪方式不同，暴露在家庭路径交叉污染评分的不确定性可能会对最终的风险排名产生较大影响，因此对模型的完善也带来巨大的挑战，但也为未来风险管理的优先排序提供了依据。

6.2 抗生素耐药细菌风险评估的不确定性因素

在耐药细菌风险评估中有许多数据和模型不确定性的实例。例如，多重耐药性的途径和耐药细菌在许多间接途径暴露和释放通常被认为是导致与抗生素耐药细菌风险评估相关的不确定性原因。此外，在动物或人类肠道内的耐药基因转移的数量和性质在很大程度上也是未知的。如果一种耐药细菌菌株能够在很长一段时间内在人体宿主内存活，并持续存在肠道内，那么这种耐药感染可能会随着时间的推移而逐渐转移。在这种情况下，对于人类健康风险评估潜在的危害分析将不够全面。因此，可靠的风险管理以及关于暴露、后果和不良健康结果信息的搜集可以减少风险评估中的不确定性。

6.3 食品中细菌的抗生素耐药性

在食品中除了从农场到餐桌过程中耐药细菌和耐药基因的交叉污染，耐药共生菌的产生也引起了广泛关注。Alban等[22]提到在某些食品生产过程中故意添加含有耐药基因的微生物（如发酵剂、益生菌和噬菌体等），而一些益生菌具有黏附于人类胃肠道上皮细胞的能力，大量摄入后，其可以长期在胃肠道中寄生，从而增加了耐药基因转移的风险。Papadopoulos等[44]评估耐甲氧西林金黄色葡萄球菌在乳制品生产链中的流行情况，在367 份检测样本（36 份散装牛奶、19 份乳制品、72 个人、185 只动物、55 个设备）中，212 份（57.8%）金黄色葡萄球菌呈阳性，几乎所有的分离株（99.6%）对至少一种抗生素有耐药性，13.3%的分离株对3 种或3 种以上的抗生素具有耐药性。在Srujana等[45]的研究中发现，从瓦朗格尔不同社区采集的所有生奶和巴氏杀菌奶样本中都含有耐药细菌，在所有样品中均发现大量氨苄西林和红霉素耐药细菌，较少的产品中发现呋喃唑胺和卡那霉素耐药细菌，未检测到氯霉素、庆大霉素、纳地西酸和新霉素耐药细菌。

6.4 从农场到餐桌耐药细菌的预防和控制措施

在发展中国家，食物链中耐药细菌的传播和转移问题更加严重，耐药细菌感染导致人类的发病率和死亡率显著增加，治疗成本也明显增加[46]。世界卫生组织全球行动计划的5 项战略目标提出：1）提高对抗生素耐药性的理解和认识；2）通过监测和研究强化知识；3）减少传染病；4）优化合理使用抗生素；5）可持续投资和开发新药[47]。即在风险评估中不断减少不确定因素，提高评估过程中的准确性，降低耐药细菌的产生概率，减少患病率。

7 结 语

当前食物链中的耐药细菌是一项全球公共卫生挑战，对人类健康、社会经济有着重要影响。因此，为了降低风险、加强监管措施，从定量风险评估入手是每个国家长期以来应采取的措施。有大量的研究认为应从食品加工过程入手来减少耐药细菌的产生以及耐药基因的转移。也有不少研究表明，从农场到餐桌的动植物制品只要经良好加工处理，人们食用时其中的耐药细菌已大量死亡，即通过遵守良好农业规范即可实现对初级植物和动物食品中细菌污染的限制。

其次，存在于共生细菌中的耐药基因可以在食品加工期间或人类摄入后转移到人源致病菌中。因此，不仅应监测源自食品生产动物以及食品中共生细菌耐药基因的存在，还要研究遗传因子，从而更好地了解它们的流行病学，以便实施最终措施来减少共生细菌在食物中的存在。

食品加工和保鲜技术对细菌的影响是可变的，但一般来说，应用这些技术处理食品后，食品上的细菌数量会减少。如热处理技术可以有效降低耐药基因转移至食物和/或人体消化系统。

对于耐药细菌风险评估，更直接的需要是描述食物途径中抗生素耐药细菌对人类健康造成的不良后果。根据公共卫生监测的大数据以及建立风险评估模型，来减轻耐药细菌对人类带来的潜在危害。