我国南北城市0～12 月不同泌乳阶段母乳蛋白质和氨基酸构成的纵向研究

逄金柱，刘正冬，贾 妮，李菊芳，裴晨红，米丽娟，李 涛，房洪涛，戴耀华

（1.内蒙古欧世蒙牛乳制品有限责任公司，北京 101107；2.首都儿科研究所，北京 100020)

母乳被认为是婴儿最理想的食物[1]，其所含蛋白质是影响婴儿生长发育至关重要的营养素，不仅能够为婴儿提供合成自身蛋白质的所需氨基酸，还在帮助婴儿抵御致病菌的入侵、促进肠道有益菌群的生长、建立肠道免疫环境和促进肠道成熟等方面发挥重要作用[2]。尽管母乳中蛋白质平均质量浓度为0.9～1.2 g/100 mL[3]，远低于牛乳和乳基婴儿配方奶粉，但母乳蛋白质氨基酸构成模式被认为最适合婴儿的需要，目前对6 月龄以下婴儿必需氨基酸的推荐摄入量即是基于母乳平均摄入量计算而得的[4]，但这些推荐摄入量仅考虑了不同哺乳阶段母乳中蛋白质摄入量的变化，而没有考虑不同泌乳阶段乳清蛋白/酪蛋白以及氨基酸构成的变化。另外由于人乳中含有的蛋白质种类和含量不同于牛乳，人乳中含有更多的乳清蛋白和较少的酪蛋白，因此人乳中蛋白质氨基酸模式也不同于牛乳，如人乳中半胱氨酸与蛋氨酸比值为1.3∶1～2∶1，远高于牛乳中1∶3[5-6]。因此，研究母乳氨基酸的构成不仅可以更好地了解婴儿喂养的营养需要，还可以为母乳替代品婴儿配方奶粉的开发提供依据。

母乳成分受到多种因素的影响而变化，包括遗传、哺乳阶段、地域和饮食习惯差异、是否足月分娩以及社会经济地位等。研究认为母乳蛋白质含量随着哺乳期的延长而下降，表现为初乳中蛋白质含量远高于成熟乳；总氨基酸含量也随泌乳期延长而下降[7-8]。不过母乳蛋白质含量受地域差异的影响并不大，有限的研究数据表明氨基酸构成会存在一些明显差异[9]。因此，对于不同哺乳阶段母乳氨基酸构成模式是否存在变化，尤其是不同地区、不同哺乳阶段母乳氨基酸构成模式是否有所差异，还需进一步的研究。另外，目前对于不同哺乳阶段母乳氨基酸的研究采用的多是横向采集的方法，在同一时间采集某地区相同泌乳期不同乳母的乳汁后按照泌乳时间建立母乳样品库后再进行分析[10-11]，由于母乳成分会受到母体基因型的影响，横向采集母乳样品的方法会对母乳成分研究结果的解释带来一些困难。而纵向队列研究可屏蔽个体差异的影响，确保研究结果准确可靠，且具有区域代表性。因此，本实验采用纵向队列研究的方法采集中国北方（北京）和南方（深圳）2 个城市乳母0～12 月不同哺乳阶段的母乳，分析和比较母乳蛋白质含量、氨基酸含量和构成模式的变化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 志愿者招募

2012年6月—2013年12月，于北京市和深圳市共募集足月分娩健康婴儿的产妇60 名，年龄35 周岁以下，身体健康，无慢性疾病和乳腺疾病，母乳喂养婴儿12 个月。所有参与者在入组前都签署了知情同意书。本研究得到了首都儿科研究所科学伦理委员会的批准。

1.1.2 母乳采集

由科研人员于上午9∶00～11∶00在医院或入户采集母乳，采用吸奶器采集单侧乳房的全部乳汁，取10～60 mL，-80 ℃保存备用。纵向采集母乳共10 次，包括初乳（3～5 d）、过渡乳（13～15 d）和成熟乳（3、4 周和2、3、4、6、9、12 月）。

1.1.3 试剂

本研究所使用试剂除特别说明外均为分析纯，水为GB/T 6682—2008《分析实验室用水规格和试验方法》中规定的一级水；石油醚、氢氧化钠（优级纯）、盐酸（优级纯）、过甲酸、氢氧化钾、硫酸铜、硫酸钾、硫酸、硼酸、甲基红指示剂、溴甲酚绿指示剂、亚甲基蓝指示剂、体积分数95%乙醇溶液、苯酚、柠檬酸钠（优级纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Kjeltec 8400全自动凯氏定氮仪 丹麦福斯公司；L-8900全自动氨基酸分析仪 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白质含量的测定

依据GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》凯氏定氮法测定母乳中蛋白质含量。

1.3.2 氨基酸含量的测定

采用氨基酸自动分析仪测定母乳中氨基酸含量，其中16 种氨基酸依据GB/T 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》采用6 mol/L盐酸溶液水解20 h后上机测试，胱氨酸在酸水解后用过甲酸氧化2 h再上机测试，色氨酸采用4.2 mol/L氢氧化钾溶液水解26 h后上机测试。

1.4 数据统计与分析

采用SPSS 22.0软件进行数据处理和统计分析。数据采用±s表示，服从正态分布时采用单因素方差（one-way analysis of variance，One-way ANOVA）分析进行组间差异比较，未知或不服从正态分布时采用Mann-Whitney U检验进行组间差异比较；采用卡方检验进行组间差异比较；同时采用One-way ANOVA进行随时间变化的线性趋势性检验，P＜0.05时组间差异有显著性。

2 结果与分析

2.1 人口学资料统计分析

表 1 乳母和婴儿的基本情况Table 1 Information abour lactating mothers and infants

从表1中可以看出，北京完成0～12 月龄调研的乳母人数为21 人，深圳为30 人。其中深圳乳母的生育年龄极显著高于北京（P＝0.002），但两个地区乳母分娩前体质量无显著差异（P＞0.05）；所有乳母均于足月分娩健康婴儿，其中北京市顺产和剖宫产人数比例约为1∶1；深圳市剖宫产人数略多于顺产人数，但经过卡方检验比较后得到两城市间顺产和剖宫产人数无显著差异（P＞0.05）；同时，两城市新生儿的出生体质量和身长也均无显著差异（P＞0.05）。

2.2 母乳蛋白质含量随泌乳时间的变化

如表2所示，采用Mann-Whitney U检验进行两城市间母乳中蛋白质含量差异比较，结果表明在0～12 月共10 个采样时间点下两城市母乳中蛋白质含量均无显著差异（P＞0.05）。随泌乳期的延长，蛋白质含量呈降低趋势。

图 1 不同泌乳阶段母乳中蛋白质含量差异比较Fig. 1 Comparison of breast milk proteins during different lactation stages

对相邻两组母乳样品采用Mann-Whitney U检验进行差异分析。从图1中可以看出，初乳中蛋白质含量最高，北京和深圳初乳中蛋白质含量分别为（2.24±0.60）g/100 g和（2.42±1.16）g/100 g；随着泌乳时间的延长，蛋白质含量均呈显著下降趋势，婴儿出生后13～15 d的过渡乳中蛋白质含量比初乳下降了20%～30%（P＝0.000），北京和深圳过渡乳中蛋白质含量分别为（1.81±0.30）g/100 g和（1.69±0.18）g/100 g。而婴儿出生后3 周和4 周时蛋白质含量无显著差异（P＝0.098），但到2 月时又产生高度显著差异（P＝0.000），这说明3 周内的母乳中蛋白质含量出现快速下降趋势，而之后其降低趋势减缓，到3 月时开始保持稳定，总蛋白质含量不再随泌乳期的延长而显著降低（P＞0.05），到12 月时北京母乳蛋白质含量平均为（0.95±0.12）g/100 g，深圳为（1.14±0.30）g/100 g。

表 2 北京和深圳不同泌乳阶段母乳中蛋白质含量Table 2 Comparison of breast milk proteins during different lactation stages from Beijing and Shenzhen

表 3 北京和深圳不同泌乳阶段母乳中总氨基酸含量Table 3 Comparison of total amino acid contents in breast milk during different lactation stages from Beijing and Shenzhen

2.3 母乳中氨基酸含量随泌乳时间的变化

从表3中可以看出，初乳中总氨基酸、总必需氨基酸和总非必需氨基酸含量均为最高，其中北京和深圳母乳的总氨基酸含量分别为（2 065.5±587.2）mg/100 g和（2 241.2±739.6）mg/100 g；总必需氨基酸含量分别为（860.3±238.9）mg/100 g和（924.4±296.6）mg/100 g；总非必需氨基酸含量分别为（1 205.2±349.1）mg/100 g和（1 316.7±445.8）mg/100 g，随着泌乳时间的延长均呈显著下降趋势（P＜0.05），到12 月时总氨基酸含量、总必需氨基酸含量和总非必需氨基酸含量均下降了约58%；而采用Mann-Whitney U检验比较各阶段下两城市母乳间的差异发现，婴儿出生13～15 d和3 周时总氨基酸、总必需氨基酸和总非必需氨基酸含量均为北京显著高于深圳（P＜0.05），其他泌乳时间下两城市间基本无显著差异（P＞0.05）。

从表4中可以看出，母乳中含量最丰富的氨基酸为谷氨酸（初乳中约330 mg/100 g），其次为亮氨酸和天冬氨酸（初乳中约200 mg/100 g）；而含量最低的氨基酸为蛋氨酸（初乳中约30 mg/100 g）和色氨酸（初乳中约40 mg/100 g）；18 种氨基酸含量均在初乳中最高，随着泌乳时间的延长均呈显著下降趋势（P＜0.05），且到12 月时18 种氨基酸的含量均降低50%以上，与总氨基酸变化趋势一致。横向比较两城市间的差异，发现除初乳和4 月的成熟乳以外，其他各月时两城市间氨基酸均有差异，其中3 周、6 月和9 月的差异氨基酸数量分别达到10、8 种和11 种。而比较两城市母乳中每一种氨基酸随泌乳时间延长的差异发现，北京母乳必需氨基酸中的赖氨酸、缬氨酸和亮氨酸在出生后的2～4 周内以及3、6、9 月时基本显著高于深圳母乳（P＜0.05）；而非必需氨基酸中的精氨酸和半胱氨酸分别在2～4 周、2、3、6 月及3～4 周、6、9 月时在两城市间有显著差异（P＜0.05）。

表 4 北京和深圳不同泌乳阶段母乳中18 种氨基酸含量Table 4 Comparison of contents of 18 amino acids in breast milk during different lactation stages from Beijing and Shenzhen

续表4

表 5 北京和深圳不同哺乳阶段单体氨基酸在总氨基酸中比例Table 5 Comparison of proportion of each amino acid to total amino acids in breast milk during different lactation stages from Beijing and Shenzhen

续表5

尽管各单体氨基酸含量随泌乳时间延长呈显著下降趋势，但其在总氨基酸中的比例却保持稳定。从表5中可以看出，从初乳到12 月的成熟乳中必需氨基酸和非必需氨基酸分别占总氨基酸的42%和58%左右。与单体氨基酸含量类似，在总氨基酸中比例最高的氨基酸为谷氨酸，其次为亮氨酸；比例最低的为蛋氨酸，其次为色氨酸。而进行两城市间比较后发现，从6 月龄开始两城市母乳中的差异氨基酸数量逐渐增多，到9 月龄时达到12 种。其中深圳母乳中苯丙氨酸在总氨基酸中的比例在除3～5 d以外的其他9 个时间点下均高于北京母乳，且除4 月外其他时间点下的差异均有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨 论

本研究采用纵向队列跟踪调查的方式考察了我国0～12 月不同泌乳阶段母乳蛋白质和氨基酸构成，样本采集点为城市经济发展水平基本一致的北京市和深圳市，由此探讨我国南北地区差异对母乳中氨基酸和蛋白质随泌乳时间变化的影响。

3.1 0～12 月泌乳期母乳蛋白质的变化

母乳中蛋白质是婴幼儿生长发育过程中的关键营养素之一，是机体构造的物质基础，也是氨基酸的重要来源。关于母乳中蛋白质含量及影响因素国外学者进行了大量研究，结果表明母乳中蛋白质平均质量浓度约为0.9～1.2 g/100 mL[3]，随着泌乳期的延长，蛋白质量浓度呈下降趋势。Guo Mingruo等[12]的研究表明3～4 月的母乳中蛋白质量浓度为0.8～1.0 g/100 mL，6 个月以后降为0.7～0.8 g/100 mL；Grote等[13]的研究发现产后1、2、3、6 月母乳蛋白质量浓度分别为1.38、1.16、1.04、0.96 g/100 mL；Nommsen等[14]纵向测试了产后3、6、9、12 月成熟乳蛋白质量浓度，分别为1.21、1.14、1.16、1.24 g/100 mL；Michaelsen等[15]分析母乳中蛋白质量浓度，分别于产后第4、14天采集母乳，之后每隔2 周采集，持续3 个月，再持续每月采集直到8 个月，样本全面覆盖初乳、过渡乳和成熟乳，结果发现蛋白质量浓度从产后第4天的1.73 g/100 mL下降到第8个月的0.77 g/100 mL，下降了约55%；Hester等[16]对健康、单胎、足月新生儿母亲乳汁成分的meta分析显示，初乳（1～5 d）蛋白质量浓度平均为2.5 g/100 mL，过渡乳（6～14 d）平均质量浓度为1.7 g/100 mL，成熟乳（大于14 d）平均质量浓度为1.3 g/100 mL。关于我国母乳中蛋白质随泌乳期的变化也有一些报道：张兰威等[17]以黑龙江哈尔滨市为采样点，发现初乳到产后3 个月成熟乳蛋白质含量逐渐下降；Shi Yudong等[18]采集了内蒙古地区母乳样品，分析了初乳、过渡乳和22～180 d成熟乳的营养组成，结果发现初乳中总氮含量为（1.38±0.07）g/100 g，到成熟乳后其含量降低为（1.27±0.33）g/100 g。

尽管前人对母乳中蛋白质含量进行了大量研究，但关于我国母乳中蛋白质含量的研究通常样本量少，采集时间点宽泛，对蛋白质随泌乳时间变化的研究受限；因此本研究采用纵向队列的方法全面考察了我国母乳从初乳、过渡乳到成熟乳共10 个时间点下蛋白质的含量，结果表明蛋白质含量从初乳中的平均2.3 g/100 g下降到12 月时的平均1.0 g/100 g，与前人的研究结果一致。关于蛋白质含量随泌乳时间的延长而下降的过程前人也进行了详细分析，Mitoulas等[19]研究了产后1～12 月成熟乳的蛋白质含量变化，结果显示泌乳期前6 个月蛋白质含量明显下降，6、9、12 个月则变化不大；而本研究发现母乳中蛋白质含量随着泌乳期的延长显著下降，但到4 月时保持稳定。Packard[20]认为成熟乳的蛋白质含量比较恒定，除膳食蛋白质摄入量不足且质量差的情况外，一般不受膳食的影响。基于前人的研究结果，本研究在经济水平较发达的一线城市开展，因此未进行膳食调查分析。Villalpando等[9]认为地域不会对母乳中蛋白质的含量产生影响，而我国21世纪初母乳调查结果发现上海城区母乳中蛋白质含量明显高于其他城市[21]；本研究发现我国南、北两城市母乳中蛋白质含量从初乳、过渡乳到成熟乳均无显著差异。

3.2 0～12 月泌乳期母乳氨基酸的变化

氨基酸是婴幼儿早期生命中必需的营养物质，众多研究表明母乳中氨基酸的构成模式最适合婴幼儿生长发育需求，常常被用来评价婴幼儿配方奶粉的质量。母乳中氨基酸含量相对稳定，对其影响最大的是泌乳时间，多项研究发现不同泌乳阶段母乳氨基酸含量变化明显[7-8,10,22-23]。本研究采用纵向队列研究方式探讨母乳氨基酸在初乳、过渡乳及成熟乳中的含量及变化趋势，同样发现氨基酸含量受泌乳时间影响最大，总氨基酸、必需氨基酸、非必需氨基酸和各单体氨基酸含量随泌乳时间延长而明显下降。Zhang Zhiying等[24]采用meta法分析了来自于13 个国家的26 项关于总氨基酸随泌乳时间变化的研究。由于文献中氨基酸质量浓度单位为mg/100 mL，本研究中依据100 mL母乳质量为104 g进行统一换算。从表6中可以看出，本研究得到的半胱氨酸和胱氨酸含量在初乳和过渡乳时高于Zhang Zhiying等[24]研究的来自13 个国家的平均含量，而其他类型氨基酸在同一泌乳时间下的含量均无显著差异。同时本研究结果与Ding Ming[11]和Garcia-Rodenas[25]等的研究结果一致：母乳蛋白质中含量最丰富的氨基酸是谷氨酸，含量最低的是蛋氨酸。谷氨酸在总氨基酸中的比例随泌乳时间延长逐渐升高，尽管谷氨酸为非必需氨基酸，可由人体代谢过程合成，但其参与乳腺代谢等重要生命过程，对婴幼儿早期营养摄入及生长发育具有重要影响[26]；蛋氨酸是一种含硫氨基酸，具有多种生物功能，新生儿不仅需要蛋氨酸用于蛋白质的周转和生长，而且其还为快速扩张的甲基化产物储备提供基质，尽管其含量最低，但由于其不能被人体代谢合成而成为婴幼儿早期发育中的必需营养物质[27]。另外，Wu等[8]报道随着泌乳期延长，谷氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、组氨酸含量有增加的趋势，苯丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、苏氨酸含量变化不大，精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、色氨酸含量有下降的趋势。本研究也发现类似的结果：亮氨酸、异亮氨酸、谷氨酸和脯氨酸比例随着泌乳期延长明显增加，色氨酸、缬氨酸、酪氨酸和半胱氨酸比例基本保持不变，但经过统计分析后认为这种变化趋势非常微弱，组间差异不具有显著性。尽管母乳中总氨基酸和各单体氨基酸的绝对含量随泌乳期延长而显著下降，但必需氨基酸和非必需氨基酸占总氨基酸比例随泌乳时间的延长基本保持稳定，而各单体氨基酸在总氨基酸中的构成比例表现出不同的变化趋势，这种变化趋势与母乳蛋白质种类的变化有关。有研究表明富含含硫氨基酸和甘氨酸的乳清蛋白和富含谷氨酸及谷氨酰胺的酪蛋白的比例随着泌乳期的延长而降低，从初乳的90∶10变为成熟乳的55∶45，甚至到6 个月后成熟乳的50∶50[28]，这与氨基酸构成模式的变化一致[29]。本研究结果显示含硫氨基酸和甘氨酸在总氨基酸中的比例随泌乳时间的延长保持稳定，而酪氨酸在总氨基酸中的比例随泌乳时间的延长逐渐升高，同样说明乳清蛋白与酪蛋白比例随泌乳时间的延长逐渐降低。

表 6 本研究与国际上关于母乳氨基酸在不同泌乳阶段下的差异比较Table 6 Comparison of amino acid contents in breast milk during different lactation stages reported in this study and the literature mg/100 g

Feng Ping等[30]报道不同地区之间母乳氨基酸含量并没有明显差异；而其他研究者发现地域会对氨基酸的含量产生影响[31-32]。因此，本研究比较了我国南北母乳蛋白质和氨基酸的地域差异，结果发现单体氨基酸含量在除初乳和4 月成熟乳外的各泌乳时间点下均有差异；而比较各单体氨基酸在总氨基酸中的比例发现，从6 月开始南北两个城市的差异单体氨基酸数量开始增多，而6 月前主要是深圳地区的苯丙氨酸含量显著高于北京地区。这种母乳氨基酸构成的地域性差异可能是由于饮食差异所造成的[33]，但也有研究认为尽管饮食是影响母乳中氨基酸组成的基础，饮食中氨基酸含量与母乳中氨基酸的含量却没有直接联系[11]。因此，对于不同地区母乳氨基酸构成差异的影响因素以及对婴儿生长发育的可能影响有待于进一步的研究。

另外，本研究中检测的是总氨基酸含量，包括蛋白质氨基酸和非蛋白质游离氨基酸。前人的研究表明游离氨基酸含量随泌乳时间的变化也会影响各氨基酸的变化趋势，如有研究发现游离谷氨酸含量随着泌乳期延长显著增加[34-35]。但由于在整个泌乳期游离氨基酸占总氨基酸比例不足3%[36]，其对婴幼儿早期的营养需求贡献也较低，同时由于游离氨基酸可直接被血液快速吸收，在整个体循环过程中存在时间非常短，受限于现有检测技术未能明确其生物学功能[24]，因此本研究未对其进行分析。

母乳中蛋白质和氨基酸的构成模式最适合婴儿生长发育的需要。由于牛乳与人乳在营养组成上的巨大差异，婴幼儿配方奶粉的营养组成无法完全复制母乳。配方奶粉研发过程中，当满足婴儿对必需氨基酸的需求时，往往蛋白质的含量与母乳相比过高；而蛋白含量与母乳相近时，部分必需氨基酸如色氨酸、半胱氨酸等的含量则不能满足要求。目前，市售的婴儿配方奶粉中蛋白质总量普遍高于母乳，而蛋白质含量过高会加重婴幼儿肾脏的代谢负担。已有多项临床实验证明，低蛋白的配方奶粉不影响婴儿的各项生理指标，且有降低其未来患有肥胖和慢性疾病的可能。同时，平衡婴儿配方奶粉中总蛋白含量与必需氨基酸含量是其在蛋白质和氨基酸组成上是否能够更贴近母乳的关键技术要点。因此，本研究将为未来营养精准化的婴幼儿配方奶粉的开发提供理论支撑。