葡萄糖转运蛋白1 在结直肠癌中的表达及其与预后的关系

武雪亮 王立坤 屈明 周海丰 郭飞 杨永江 刘博 杨东东 薛军

河北北方学院附属第一医院1普通外科，2超声医学科，3病理科（河北张家口075000）

据报道20～40 岁的青年结直肠癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者，其5年生存率分别为87.9%、75.4%、51.3%、8.0%，60岁以上老年患者的5年生存率则分别为91.9%、69.8%、52.8%、6.6%，因此早期诊断、合理治疗和有效的预后监测是提高结直肠癌疗效的关键［1-2］。但目前临床常用的肿瘤标志物如CEA、CA199等的早期检测并不令人满意，因而，寻求一种特异性高、敏感性强的生物学指标势在必行。

葡萄糖转运蛋白-1（glucose transporter⁃1，GLUT⁃1）是葡萄糖转运蛋白家族中的重要成员，广泛分布于机体的细胞膜上，是介导葡萄糖摄取的主要转运载体，其表达水平与机体细胞葡萄糖代谢水平密切相关。相关报道证实［3-5］，GLUT⁃1 在前列腺癌、胃癌、乳腺癌、头颈癌、肺癌等多种癌症中均有过表达。但目前，GLUT⁃1 在结直肠癌方面的研究较少，相关的致癌机制和通路尚不明确。本研究通过检测GLUT⁃1 在结直肠癌中的表达情况，分析其与相关临床病理因素间的关系，结合生存时间的随访，为结直肠癌的早期诊断、治疗和预后监测提供准确、可靠的生物学指标。

1 资料与方法

1.1 病例资料 本次实验对象为2012年2月至2014年2月间河北北方学院附属第一医院病理确诊结直肠癌组织和癌旁正常组织标本各50 例，同时收集患者完整的临床资料。

1.2 主要试剂与实验方法

1.2.1 主要试剂 鼠抗人Glut⁃1（NBP1⁃35926）购于上海煊翎生物科技有限公司，羊抗鼠IgG⁃HRP二抗（SE134），购于北京索莱宝科技有限公司，DAB（P0202），上海碧云天生物公司，PBS 液（PH 7.2～7.4）购于广州鼎国生物科技有限公司，构椽酸盐缓冲液（PH 6.0）购于广州鼎国生物科技有限公司；反转录试剂盒购于长沙达尔锋生物科技有限公司，SDS⁃PAGE 标准指示剂、RIPA 试剂购于上海基星生物科技有限公司、BCA 蛋白定量试剂盒购自美国Life Technologies 公司。

1.2.2 RT⁃PCR 法检测GLUT⁃1 mRNA 表达 提取并测定总RNA，设计GLUT⁃1 上游引物：5′⁃TCT⁃CTGGGTAAACAGGGATCAAACA⁃3′，下游引物：5′⁃TGAGGAGCAGGAAGGGTC⁃3′；GAPDH 上游引物：5′⁃GGTGAAGGTCGGAGTCAACGG⁃3′，下游引物：5′⁃CCTGGAAGATGGTGATGGGATT⁃3′；反应体系：1×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 0.5 μL，cDNA 模板2 μL，Taq 酶1.25 U，上下游引物各1 μL，RNA 酶抑制剂1 μL，反应总体积25 μL。根据试剂盒说明书操作进行扩增，产物经琼脂电泳后以Labworks 4.5 图像分析系统分析。

1.2.3 Western blot 法检测GLUT⁃1 蛋白表达 提取正常肠粘膜、腺癌组织50 mg 蛋白，置入5×缓冲液（4∶1），100 ℃水浴，8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，后转至PVDF 膜，取出膜，加5%脱脂奶粉封闭，滴加特异性的一抗（GLUT⁃1 为1∶1 500，GAPDH 为1∶150）-4 ℃孵育过夜，滴加特异性二抗（1∶1 500），37 ℃孵育1h，再次加入TBST 洗涤液，荧光成像检测定量分析，计算目的蛋白相对表达量。

1.2.4 免疫组织化学染色检测GLUT⁃1 蛋白表达 制作结直肠腺癌和正常黏膜的石蜡包埋组织，用10%福尔马林固定，石蜡包埋并切片3～4 μm厚。石蜡切片放入3%H2O2，二甲苯（Ⅱ脱蜡各10 min，梯度酒精100%2 min，95%2 min，80%，2 min，70%2 min，蒸馏水洗2 次每次5 min（置于摇床）。3%H2O2中浸泡10 min，蒸馏水洗涤。高压抗原修复90 s，室温冷却，PBS 洗涤切片。滴加5%BSA 封闭液，37 ℃孵育30 min，滴加GLUT1 一抗（1∶200），4 ℃过夜，37 ℃孵育生物素化的二抗30 min。苏木素复染细胞核半分钟，DAB 显色，盐酸乙醇脱水至透明、树胶封片，光镜下观察。

1.2.5 结果判定［6］GLUT⁃1 阳性染色主要集中于细胞浆和细胞膜中，呈棕黄色或褐色颗粒，光镜下每个样本随机取五个高倍视野（× 400）的阳性细胞数，取其均值作为GLUT⁃1 细胞数，其中≥1%的细胞着色定为阳性。

1.2.6 随访 通过门诊复查、电话随访，时间为2018年10月30日。

1.3 统计学方法 应用SPSS 17.0 统计软件分析，计量资料以均数±标准差表示，两组比较采用t检验，计数资料以百分率表示，两组比较运用χ2检验，多组比较应用方差分析，GLUT⁃1 阳性表达组和阴性表达组之间的生存差异应用Log⁃rank 检验计算，用GraphPad Prism 6 软件绘制统计图，设α=0.05 为检验水准。

2 结果

2.1 RT⁃PCR 检测GLUT⁃1 的表达 以GLUT⁃1/GAPDH 比值作为RT⁃PCR 定量分析，癌组织中GLUT⁃1 mRNA 的表达水平（0.96 ± 0.05）明显高于结直肠正常组织（0.17±0.02），有统计学差异，P=0.003，见图1。

2.2 Western blot 检测结直肠正常黏膜、腺癌组织中GLUT⁃1 蛋白的表达情况 以GLUT⁃1/GAPDH比值作为GLUT1 相对表达量，显示与正常肠粘膜组织（0.17 ± 0.05）相比，腺癌（0.84 ± 0.06）组织中的表达明显升高，上升趋势明显，差异有统计学意义，P＜0.05，见图2。

图1 RT⁃RCR 检测GLUT⁃1 在结直肠正常黏膜、结直肠腺癌中的表达水平Fig.1 Expressions of GLUT⁃1mRNA in normal colorectal mucosa and colorectal adenocarcinoma were detected by RT⁃PCR

2.3 免疫组化检测结直肠正常黏膜、腺癌组织中GLUT1蛋白的表达情况 结直肠癌组织中GLUT⁃1的阳性表达率为68.00%（34/50）明显高于在正常组织中的表达16.00%（8/50），差异有统计学意义，P＜0.05，见图3。

图2 Western blot 检测GLUT⁃1 蛋白在结直肠正常黏膜、结直肠腺癌中的表达水平Fig.2 Expressions of GLUT⁃1 protein in normal colorectal mucosa and colorectal adenocarcinoma were detected by Western blot

2.4 GLUT⁃1 表达与结直肠癌临床病理特征的关系 GLUT⁃1 的表达均与肿瘤的浸润深度、TNM 分期、淋巴结转移、肝转移及脉管浸润相关（均P＜0.05）。TNM 分期高、分化越低、伴淋巴结转移、肝转移和脉管浸润的患者GLUT⁃1 的表达均增强；GLUT⁃1 在CEA（+）、CA199（+）组织中的表达明显高于CEA（-）、CA199（-）组，P＜0.05，而GLUT1 的阳性表达与患者肿瘤大小无相关性（均P＞0.05），见表1。

2.5 生存分析 将患者分为GLUT⁃1 阳性组和阴性组，通过对患者进行短期随访，记录患者的生存时间，同时分别绘制生存曲线，GLUT⁃1 阳性组的中位生存时间为267 d（95%CI：230.07～303.93），最长生存时间为359 d；阴性组的中位生存时间为307 d（95%CI：279.16～335.82），最长生存时间为365 d，两组间的生存曲线差异具有统计学意义，P=0.031，见图4。

表1 结直肠癌组织中GLUT⁃1 的表达及与临床病理参数的关系Tab.1 The relation of GLUT⁃1 expression and the clinicopathological parameters in the colorectal tissues

图3 免疫组化检测GLUT⁃1 在结直肠正常黏膜、结直肠腺癌中的表达（×400）Fig.3 Expressions of GLUT⁃1 protein in normal colorectal mucosa and colorectal adenocarcinoma were detected by IHC

图4 生存曲线Fig.4 Suvival cure

3 讨论

研究［7］认为，肿瘤的恶性生物学行径必须依赖足够的能量支撑，而葡萄糖的无氧糖酵解是其获能的最主要途径，这种获能方式即使在高氧环境下亦能保证正常进行，因而这就要求必须要有足够的葡萄糖供应。

GLUT⁃1 是葡萄糖转运体家族中的重要成员，在真核生物和原核生物中均有发现，是所有膜传输研究最深入的蛋白质。GLUT⁃1 最初发现存在于红细胞、血脑屏障、眼、胎盘、周围神经和哺乳乳腺的内皮细胞中，通常在正常上皮细胞和良性上皮肿瘤中无法检测到，但在人类多种恶性肿瘤中均发现GLUT⁃1 表达增加［8-10］。GLUT⁃1 在肿瘤发生、发展过程中，包括早期肿瘤生长，转移和侵袭等方面均发挥重要作用。GLUT⁃1 介导肿瘤细胞内的基础葡萄糖转运，为肿瘤细胞能量代谢提供葡萄糖，其诱导血管生成是肿瘤发生、进展的标志，当癌细胞生长超过现有的血管支撑时，就会发生缺氧，因此，癌细胞通过激活负责葡萄糖运输的基因，即GLUT⁃1 来对缺氧条件作出反应［11］。GLUT⁃1在恶性肿瘤中的调控机制涉及不同的信号分子和通路，包括PI3K/Akt 信号通路、缺氧诱导因子1（HIF⁃1）、Ras、c⁃Myc和抑癌蛋白p53。研究证实［12］，在胃癌、肝癌细胞内，HIF⁃1α能直接激活GLUT⁃l、胚胎丙酮酸激酶（PKM⁃2）、己糖激酶-1（HK⁃1）和2（HK⁃2）、乳酸脱氢酶A（LDH⁃A）等糖酵解相关因子的活性，加速糖酵解，促进能量摄取。周晓黎等［13］研究证实，GLUT⁃1 基因沉默通过阻断PI3K/AKT 信号途径，降低HIF⁃1α表达，诱导相关代谢酶下调，从而抑制肿瘤细胞的代谢和生长。此外，文献中还报道GLUT⁃1 受胰岛素样生长因子-1、血小板源性生长因子、白介素-1 和TNF 等因子影响，共同调控肿瘤细胞的葡萄糖代谢［14］。

本研究从基因和蛋白两方面均证实了在结直肠癌细胞中GLUT⁃1 mRNA 和蛋白水平明显高于正常肠黏膜细胞，表明在肠粘膜癌变的过程中急需大量能量，而GLUT⁃1 水平的上调保证了肿瘤对能量的摄取。进一步研究显示，GLUT⁃1表达水平与结直肠癌的分化程度、病理分期、浸润深度、转移均明显相关，且与CEA、CA199 等肿瘤标记物亦相关，因而表明GLUT⁃1 表达的异常激活了肿瘤细胞的活性并促进其侵袭增殖，从而加速癌细胞的扩散和转移。GABALLAH 等［15］通过定量实时聚合酶链反应检测47 名结肠癌患者和20 名健康对照者的外周血标本中的GLUT1 表达，结果表明GLUT1在癌患者的表达远高于健康者，且GLUT1 的表达与肿瘤分期（P=0.01）和转移情况（P=0.009）显著相关，与本研究结果一致。此外，WANG 等［16］研究表明在结直肠癌变及化疗耐药过程中，同样证实GLUT⁃1 作为无氧糖酵解关键性因子发挥重要作用。本研究通过生存期的随访证实，GLUT⁃1的表达与结直肠癌患者生存期相关，阳性表达者生存时间明显低于阴性表达者，因而GLUT⁃1 的表达水平可作为结直肠癌患者的重要的预后监测指标。杨通印等［17］研究证实联合检测GLUT⁃1、HIF⁃1α及LDH⁃5 在结直肠癌的表达，可作为评估结直肠癌的发展及预后的分子指标。YANG等［18］通过Meta分析亦证实GLUT⁃1 是结直肠癌患者侵袭性（P=0.03）和无疾病生存期（P=0.013）的重要生物学标志物，以上均与本研究成果一致。

综上，GLUT⁃1 表达的异常升高参与了结直肠癌的发生和进展过程，且与预后相关，本研究所纳入的样本量尚小，今后要继续扩大样本量；此外，尚缺乏对其具体致癌机制和相应转导通路方面的研究，这也将是本课题下一步的研究方向。