柑橘类果皮提取物对荞麦立枯丝核菌的抑制作用

江 兰， 赵江林*， 汤 焘， 李 兴， 钟灵允， 袁 健， 赵 钢

(1.成都大学 农业农村部杂粮加工重点实验室，四川 成都 610106；2.西昌市正中食品有限公司，四川 西昌 615000)

荞麦为蓼科(Polygonaceae)荞麦属(Fagopyrum)双子叶植物，是一种著名的特色杂粮作物。荞麦含有蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸、维生素和矿质微量元素，还富含生物黄酮、D-手性肌醇、γ-氨基丁酸等活性功能成分[1-4]。研究表明，荞麦及其制品在预防和辅助治疗高血压、高血脂、糖尿病，增强机体免疫力、抗氧化、防衰老，以及改善亚健康状态等方面具有较好功效[1,5]。近10年来，随着我国荞麦种植面积的不断扩大，荞麦病害的发生也呈逐年加重趋势，其中，由立枯丝核菌(RhizoctoniasolaniKühn)引起的荞麦立枯病害导致荞麦烂种、烂芽、缺苗断垄或幼苗萎蔫枯死等[6]，可致荞麦年产量损失达15%以上，且降低荞麦的品质[7-8]；其分泌产生多种对人畜有害的代谢物和毒素，直接或间接对农产品的质量安全构成极大威胁[9]。目前，生产上主要以喷施多菌灵、福美双、代森锌及克菌丹等农药进行防治，但长期使用这些化学药剂又易使病原菌的抗性增强，生成农药残留及环境污染等[7]，因此，急需开发低毒、高效、低残留且环境友好型的植物源杀菌剂替代这些化学农药，对保障食品安全，促进我国荞麦产业健康发展具有重要意义。

柑橘为芸香科(Rutaceae)柑橘亚科柑橘属(Citrus)植物。我国柑橘资源十分丰富，是世界上第一大种植国。柑橘在加工生产过程中通常有30%～45%的皮渣副产物生成[10]。研究发现，柑橘皮渣中富含黄酮类化合物、类柠檬苦素及挥发油等多种功能性成分，其具有较好的抗菌、杀虫、抗氧化、抗病毒和消炎等生物活性[11-15]，具有广阔的开发应用价值。迄今为止，尚未见有关于柑橘类果皮提取物对荞麦立枯丝核菌抑制活性的研究报道。基于此，采用菌丝生长速率法研究了6种代表性柑橘类果皮提取物对荞麦立枯丝核菌菌丝生长的抑制作用，以期筛选出具有较好抑菌活性的提取物，为柑橘属植物果皮的开发利用及荞麦立枯病等病害新型植物源防治药剂的开发研制提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 病原菌菌株 荞麦立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani，Rs-1)，由成都大学-农业农村部杂粮加工重点实验室提供。

1.1.2 柑橘 蜜柚(CitrusgrandisOsbeck)、脐橙(CitrussinensisOsbeck)、椪柑(CitrusreticulataBlanco cv.Ponkan)、柠檬(CitruslimonBurm.f.)、不知火〔Citrusreticulata×(C.reticulata×C.sinenesis)〕、沙糖橘(Citrusreticulatacv. Shiyueju)，市售。

1.1.3 试剂 多菌灵(Aldrich公司)、95%乙醇(成都市科隆化学品有限公司)、琼脂粉(成都市科龙化工试剂厂)、无水葡萄糖(成都市科龙化工试剂厂)，市售。

1.1.4 仪器与设备 DHP-9160B智能型恒温培养箱，上海朗玗实验设备有限公司；LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；JJ-CJ-1FD洁净台，苏州市金净净化设备科技有限公司；R-20旋转蒸发器，上海申顺生物科技有限公司；HH-4数显恒温水浴锅，常州澳华仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 材料预处理

1) PDA培养基的制备。称取洗净去皮的马铃薯200.0 g，切粒，加水1000 mL煮沸至烂，纱布过滤后收集汁液，再加入葡萄糖20.0 g和琼脂20.0 g，搅拌加热至琼脂粉完全溶解，加水定容至1 000 mL，摇匀后分装到锥形瓶内，封口，121℃高压蒸汽灭菌20 min，备用。

2) 菌株活化。试验前将荞麦立枯丝核菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，置于28.5℃恒温培养箱中活化培养，暗培养3～5 d。

3) 柑橘类果皮提取物的制备。分别将6种柑橘果皮切成1 cm2(1 cm×1 cm)小块，热水回流2 h，过滤除杂，收集上清液。然后分别将制备果皮水提物后剩余的滤渣按照1∶1.2(m/v)的料液比加入95%乙醇，在室温下浸提1周，过滤除杂，收集上清液。采用旋转蒸发仪对2种上清液分别进行浓缩，近干后转入50～55℃的烘箱中烘干至恒重，即得柑橘类果皮水提物和醇提物。将其密封保存于4℃冰箱内备用。

4)带毒平板制备。用分析天平分别称取6种柑橘果皮水提物各0.2 g、0.4 g、0.8 g和1.2 g，依次加入到50 mL的PDA中，制备成浓度为4.0 mg/mL、8.0 mg/mL、16.0 mg/mL和24.0 mg/mL的水提物带药培养基；另用分析天平分别称取6种柑橘果皮醇提物各0.1 g、0.2 g和0.3 g，依次加入到50 mL的PDA中，制备成浓度为2.0 mg/mL、4.0 mg/mL和6.0 mg/mL的醇提物带药培养基。将各水提物和醇提物带药培养基倒皿，冷却后备用。

1.2.2 提取物对立枯丝核菌菌丝生长的抑制作用 采用菌丝生长速率法(mycelia growth rate)检测各提取物对荞麦立枯丝核菌菌丝生长的抑制作用[1]。在培养皿中央移入已活化好的荞麦立枯丝核菌菌饼(Φ=7 mm )，每皿1个，3 次重复。以蒸馏水为空白对照(CK)，5 μg/mL多菌灵为阳性对照(CK+)。随后将培养皿倒置于28℃恒温培养箱中培养，待空白对照平板菌丝长满平皿的90%时，采用十字交叉法测量菌落直径，并计算抑制率。

抑制率=[(溶剂对照菌落拓展直径-处理菌落拓展直径)/溶剂对照菌落拓展直径]×100%

1.2.3 提取物对荞麦立枯丝核菌菌丝生长抑制中浓度(IC50)的测定 选取对荞麦立枯丝核菌菌丝生长抑制活性较强的4种提取物(沙糖橘醇提物、蜜柚醇提物、椪柑醇提物和柠檬醇提物)，进一步测定其IC50。将各提取物分别配制为沙糖橘醇提物(0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、4.0 mg/mL和6.0 mg/mL)、蜜柚醇提物(1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、4.0 mg/mL、6.0 mg/mL和8.0 mg/mL)、椪柑醇提物(1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、3.0 mg/mL、6.0 mg/mL和9.0 mg/mL)和柠檬醇提物(1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、4.0 mg/mL、6.0 mg/mL和8.0 mg/mL)的带药培养基，活性测定方法同上。将提取物浓度(μg/mL)换算成浓度对数(X)，抑制率换算成生物统计几率值(Y)，并求得其相关回归方程Y=aX+b ，根据线性方程求IC50。

1.3 数据分析

采用Excel 2010和SPSS 20.0对相关数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 柑橘类果皮水提物对荞麦立枯丝核菌菌丝生长的抑制作用

从图1和图2看出，6种柑橘果皮水提物对荞麦立枯丝核菌菌丝生长均具有一定的抑制作用，但整体活性较弱；随着处理浓度升高，6种柑橘果皮水提物的抑制作用均呈增强趋势，菌落直径逐渐减小，抑菌圈逐渐增大；浓度为4.0～24.0 mg/mL时，果皮水提物的抑制率为17.5%～61.5%。其中，椪柑和沙糖橘果皮水提物的抑制活性相对较强，浓度为24.0 mg/mL时，其提取物对荞麦立枯丝核菌菌丝生长的抑制率分别为61.5%和59.3%，二者差异不显著；该浓度下椪柑果皮水提物的抑制活性显著高于其余果皮水提物，沙糖橘果皮水提物的抑制活性显著高于除蜜柚外的其余果皮水提物。

注：A，沙糖橘；B，蜜柚；C，不知火；D，椪柑；E，脐橙；F，柠檬；CK，水；CK+，5 μg/mL多菌灵；A～F的浓度单位为mg/mL。Note: A，C.reticulata cv.Shiyueju; B，C.grandis; C，C.reticulate×(C.reticulate×C.sinenesis); D，C.reticulata Blanco cv.Ponkan; E，C.sinensis; F，C.limon; CK，water; CK+，5 μg/mL Carbendazim;Concentration unit，mg/mL.

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同。Note: Different lowercase letters indicate significance of difference at P<0.05 level.The same below.

2.2 果皮醇提物对立枯丝核菌菌丝生长的抑制作用

由表1可见，6种柑橘果皮醇提物对荞麦立枯丝核菌菌丝的生长均有一定的抑制作用，其活性大小与提取物类别及处理浓度有关；随着处理浓度升高，6种柑橘果皮醇提物的抑制率均呈升高趋势。其中，沙糖橘果皮醇提物对荞麦立枯丝核菌菌丝

表1 6种柑橘果皮醇提物对荞麦立枯丝核菌菌丝生长的抑制率Table 1 Inhibitory rate of ethanol extracts from six citrus fruits’ peels against mycelia growth of R.solani of buckwheat

生长的抑制率最高，蜜柚、柠檬和椪柑果皮醇提物的抑制活性次之。沙糖橘果皮醇提物浓度为2.0～6.0 mg/mL时对荞麦立枯丝核菌菌丝生长的抑制率为70.0%～75.2%，处理间无显著差异，但均显著高于除阳性对照外的其余处理。当处理浓度为6.0 mg/mL时，沙糖橘、蜜柚、柠檬和椪柑果皮醇提物对荞麦立枯丝核菌菌丝生长的抑制率分别为75.2%、66.0%、60.1%和57.3%；不知火和脐橙果皮醇提物的抑制作用相对较弱，其抑制率分别为40.8%和43.7%。

2.3 果皮醇提物对立枯丝核菌生长的抑制中浓度

6种柑橘果皮醇提物对荞麦立枯丝核菌菌丝生长的抑制活性较相应水提物的抑制作用强，其中，沙糖橘、柠檬、蜜柚和柠檬等4种柑橘的果皮醇提物对荞麦立枯丝核菌菌丝生长的抑制活性相对较强。因此，选用4种醇提物进一步测定其对荞麦立枯丝核菌菌丝生长的抑制中浓度(IC50)。从图3和图4可知，随着供试浓度的增加，4种柑橘果皮醇提物对荞麦立枯丝核菌菌丝生长的抑制效果均呈上升趋势，菌落直径逐渐减小，抑菌圈逐渐增大；在供试浓度范围内，沙糖橘、蜜柚、椪柑和柠檬的果皮醇提物对荞麦立枯丝核菌Rs-1的抑制作用呈一定的量效关系，经拟合得到4种柑橘果皮醇提物的浓度-抑制活性曲线分别为Y沙糖橘=1.210 6x+1.233 9(R2=0.907 6)、Y蜜柚=0.899 5x+2.018 2(R2=0.946 2)、Y椪柑=1.038 0x+1.284 7(R2=0.998 3)和Y柠檬=0.827 1x+2.179 8(R2=0.988 9)，表明，其浓度与活性之间的线性关系良好(R≥0.952 7)。由此计算得到4种醇提物对荞麦立枯丝核菌菌丝生长的IC50分别为沙糖橘1.29 mg/mL，蜜柚2.07 mg/mL，柠檬2.57 mg/mL和椪柑3.80 mg/mL。表明，沙糖橘醇提物对荞麦立枯丝核菌的抑制作用最强，其次为蜜柚、柠檬和椪柑醇提物。

注：A，沙糖橘；B，蜜柚；C，椪柑；D，柠檬；CK，水；CK+，5 μg/mL多菌灵；A～D的浓度单位为mg/mL。Note: A，C.reticulata cv.Shiyueju; B，C.grandis; C，C.reticulata Blanco cv.Ponkan; D，C.limon; CK，water; CK+，5 μg/mL Carbendazim; Concentration unit，mg/mL.

图4 沙糖橘、蜜柚、椪柑和柠檬果皮醇提物对荞麦立枯丝核菌的抑制活性Fig.4 Inhibitory activity of different ethanol extracts from peels of C.reticulata cv.Shiyueju,C.Grandis,C.reticulata Blanco cv.Ponkan and C.Limon against mycelia growth of R.solani of buckwheat

3 结论与讨论

研究结果表明，6种柑橘果皮提取物对荞麦立枯丝核菌菌丝生长均具有一定的抑制效果，其活性大小与供试浓度呈正相关关系，且其果皮醇提物对荞麦立枯丝核菌的抑制作用均较相应水提物的强。在供试浓度为6.0 mg/mL时，沙糖橘果皮醇提物对荞麦立枯丝核菌菌丝生长的抑制效果最好，其抑制率达75.2%；蜜柚、柠檬和椪柑果皮醇提物的活性次之，其抑制率分别为66.0%、60.1%和57.3%；不知火和脐橙果皮提取物对荞麦立枯丝核菌的抑制活性相对较弱。沙糖橘、蜜柚、柠檬和椪柑等4种柑橘果皮醇提物对荞麦立枯丝核菌菌丝生长的抑制中浓度(IC50)分别为1.29 mg/mL、2.07 mg/mL、2.57 mg/mL和3.80 mg/mL，具有较高的开发利用价值。后期将对这些提取物中抑菌活性成分的化学结构特征、抑菌作用机制、田间防治效果及活性成分的提取制备工艺等方面进行进一步深入研究，进而为荞麦立枯病新型防治药剂的开发研制和柑橘皮附加值的提升奠定基础。