消退素D1抑制NLRP3信号通路对DSS结肠炎小鼠的影响

方 晨，梅咏玉，王 晶，杨 彬，刘晓昌，许建明，梅 俏

(安徽医科大学第一附属医院消化内科，安徽省消化病重点实验室，安徽 合肥 230022)

炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是一种病因尚不完全明确的慢性肠道炎症性疾病。IBD的发病机制可能与遗传、感染、环境、免疫等因素有关，其中，黏膜免疫异常在IBD的持续肠道炎症过程中具有重要作用[1]。

IBD治疗的主要方向是恢复促炎因子与抗炎因子之间的平衡[1]，调节肠道黏膜免疫异常。在肠道免疫功能的调节过程中，炎症小体的活化发挥重要影响，其中NOD样受体家族3(NOD-like receptor protein 3, NLRP3)炎症小体是目前研究最广泛的炎症小体，参与了炎症性疾病的发生、发展。Zhang等[2]研究发现，NLRP3基因多态性与IBD风险增加有关。NLRP3炎症小体是一种多蛋白复合物，负责IL-1β和IL-18的蛋白水解成熟和分泌。NLRP3炎症小体由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白[apoptosis associated speck-like protein containing a caspase activation and recruitment domain(CARD)，ASC]和胱天蛋白酶 1(caspase-1)组成，被激活时，NLRP3受体通过ASC聚合并募集和活化pro-caspase-1，活化的caspase-1切割无活性的pro-IL-1β和pro-IL-18，并以成熟形式分泌，加重IBD中肠道炎症过程[3]。

炎症消退是炎症过程的重要调控机制，由一系列抗炎介质控制，其中消退素 D1(resolvin D1，RvD1)是体内重要的促炎症消退因子。RvD1最早由小鼠腹腔炎性渗出物中分离，是由ω3- 二十二碳六烯酸(DHA)衍生的内源性抗炎和促进炎症消退的脂质分子。RvD1发挥限制中性粒细胞黏附与浸润、限制炎症损伤等作用[4]。Bento等[5]、Norling等[6]在结肠炎、关节炎等方面研究均证明RvD1可以改善组织炎症，保护相关器官功能，但RvD1抗结肠炎的具体机制尚不十分清楚。因此，本研究通过探讨RvD1对结肠炎小鼠肠道炎症过程中NLRP3信号通路的影响，为RvD1抗结肠炎作用提供实验依据。

1 材料

1.1实验动物C57BL/6小鼠32只，♂，6～8周龄，体质量(18～22) g，购自安徽省动物中心，No.34000200001280。实验前适应性饲养1周，温度(20～26) ℃，相对湿度40%～70%。

1.2试剂葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate, DSS)，美国Sigma公司；RvD1，美国Cayman公司；髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)试剂盒，南京建成生物工程研究所；IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α试剂盒，均购自武汉新启迪生物科技有限公司；抗诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、NLRP3、ASC、caspase-1 p20、IL-1β、pro-IL-1β抗体，均购自Bioss生物科技有限公司；抗β-actin抗体，北京中杉生物科技有限公司；DNA合成试剂盒，美国Thermo Scientific公司；QuantiNova SYBR Green PCR试剂盒，德国Qiagen公司。

1.3仪器EPS 300型电泳仪(上海天能科技有限公司)；TS-1000水平摇床(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；K960型PCR仪(杭州晶格科学仪器有限公司)；PikoReal 96型荧光定量PCR仪(Thermo Scientific公司)；高速台式冷冻离心机(安徽嘉文仪器装备有限公司)；Elx800型酶标仪(美国 Bio-Tek公司)；752N型可见紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。

2 方法

2.1模型的制备与实验分组按Chu等[7]方法，使用DSS建立小鼠实验性结肠炎模型。实验分为4组：A组为正常组，小鼠自由饮水，并腹腔注射生理盐水；B组为RvD1对照组，小鼠自由饮水并腹腔注射RvD1；C组为DSS模型组，小鼠给予5% DSS溶液自由饮用，并腹腔注射生理盐水；D组为RvD1给药组，小鼠给予5% DSS溶液自由饮用，并腹腔注射RvD1。将RvD1溶于生理盐水，分别于d 2、4、6进行小鼠腹腔注射(50 μg·kg-1)。实验d 8处死所有小鼠，分离血清于-80 ℃保存，同时收集小鼠小肠和结肠组织，待测样品液氮储存。

2.2结肠炎程度评估实验期间每天观察小鼠体质量、大便性状和便血情况，进行疾病活动指数(disease activity index，DAI)评分[8]。大便隐血检测采用潜血检测试纸进行。将取出的结肠组织用福尔马林固定并石蜡包埋，切片厚4 μm，HE染色，进行组织学指数(histological index，HI)评分[9]。用生理盐水制备10%结肠组织匀浆。按ELISA试剂盒说明，检测结肠组织匀浆中MPO活性。

2.3小肠黏膜通透性检测按文献方法[10]制备小肠肠囊，注入伊文思蓝0.2 mL，置于20 mL Krebs液烧杯中，95% O237 ℃水浴，30 min后取出肠囊组织，生理盐水冲洗肠腔，37 ℃干燥，加入1 mL甲酰胺溶液，50 ℃孵育24 h，取出肠组织，溶液离心沉淀，取上清液进行紫外分光光度计检测，检测波长为655 nm。

2.4透射电镜观察将小肠组织于2.5%戊二醛中4 ℃固定6 h，1%锇酸固定，梯度浓度乙醇脱水，环氧树脂包埋，70 nm切片，JEM-1230F电子显微镜观察小鼠小肠黏膜上皮细胞连接情况。

2.5结肠组织中IL-1、IL-6、IL-10和TNF-α水平测定按ELISA试剂盒说明书，检测小鼠结肠组织中IL-1、IL-6、IL-10和TNF-α水平。

2.6Westernblot检测结肠组织中相关蛋白的表达从结肠组织中提取蛋白质，使用SDS-PAGE分离，并转移至PVDF膜。在室温下用封闭液(5%脱脂乳)封闭2 h。将膜与一抗在4 ℃孵育过夜，一抗包括ASC、NLRP3、caspase-1、IL-1β、pro-IL-1β、iNOS(1 ∶300)及β-actin(1 ∶1 000)。TBST洗涤，将HRP连接的二抗在室温下与膜孵育2 h。再次洗涤，使用ECL蛋白质印迹检测系统和ImageJ软件检测分析结果。

2.7qPCR检测小鼠结肠组织IL-1β、iNOSmRNA表达使用TRIzol试剂从巨噬细胞和结肠组织中提取总RNA。用RevertAidTMM-MuLV逆转录酶进行逆转录，合成DNA第一链，并按DNA合成试剂盒的说明，将RNA逆转录成cDNA。使用QuantiNova SYBR Green PCR试剂盒扩增获得的cDNA用于定量PCR。以β-actin作为内参，测量目的基因相对表达。引物序列(正向和反向)为：β-actin：5′-AGTGTG ACGTTGACATCCGT-3′和5′-TGCTAGGAGCCAGAG CAGTA-3′; iNOS：5′-CCTTGTTCAGCTACGCCTTC-3′和5′-CTTCAGAGTCTGCCCATTGC-3′; IL-1β：5′-GA AGAAGAGCCCATCCTCTG-3′和5′-TCATCTCGGAGC CTGTAGTG-3′。

3 结果

3.1RvD1对结肠炎小鼠肠道炎症的影响与正常组小鼠相比，模型组小鼠DAI评分、HI评分、MPO水平明显升高(Fig 1A、1B、1C)，病理可见结肠中大量中性粒细胞浸润，隐窝明显减少，并累及部分上皮细胞(Fig 1D)；RvD1组小鼠DAI评分、HI评分及MPO水平明显降低，病理可见结肠中性粒细胞浸润减少，隐窝数量基本正常，表明RvD1可以改善DSS结肠炎小鼠中结肠炎症损伤程度。

3.2RvD1对结肠炎小鼠肠黏膜屏障功能的影响如Fig 2所示，与正常组小鼠相比，模型组小鼠小肠肠囊中伊文思蓝浓度明显上升，电镜可见小肠上皮细胞绒毛杂乱，密度不均，细胞间连接增宽；RvD1组小鼠小肠肠囊中伊文思蓝浓度降低，电镜可见上皮绒毛稍稀疏，但排列规整，细胞间隙基本正常，表明RvD1可改善DSS引起的小鼠小肠结构和功能破坏。

3.3RvD1对结肠炎小鼠结肠组织匀浆IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α水平的影响Tab 1结果显示，与正常组小鼠相比，模型组小鼠结肠组织中IL-1、IL-6、TNF-α水平增高，IL-10水平降低；与模型组小鼠相比，RvD1组小鼠结肠组织中IL-1、IL-6、TNF-α水平降低，IL-10水平增加。提示RvD1可调节DSS结肠炎小鼠肠黏膜中细胞因子水平，发挥抗结肠损伤作用。

Fig 1 Effect of RvD1 on colonic inflammation in DSS-induced colitis

A:DAI scoring; B: HI scoring; C: MPO activity; D: Histopathologic features of the colon. a: Normal group; b: RvD1 control group; c: Model group;d: RvD1 group.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsmodel group.

3.4RvD1对DSS结肠炎小鼠结肠组织中NLRP3炎症小体表达的影响通过Western blot及qPCR检测结肠炎小鼠结肠NLRP3炎症小体相关标志物，包括ASC、NLRP3、IL-1β、pro-IL-1β、iNOS、caspase-1 p20。如Fig 3所示，与正常组小鼠比较，模型组小鼠结肠中ASC、NLRP3、IL-1β、pro-IL-1β、iNOS、caspase-1p20水平升高；与模型组小鼠比较，RvD1组小鼠结肠中ASC、NLRP3、IL-1β、pro-IL-1β、iNOS、caspase-1 p20水平降低。表明RvD1可降低NLRP3炎症小体信号通路中主要标志物的表达水平，改善结肠炎小鼠肠道炎症程度。

Fig 2 Effect of RvD1 on intestinal barrier function and structure in DSS-induced colitis mice

*P<0.05vsnormal group,#P<0.05vsmodel group

Tab 1 Effect of RvD1 on contents of IL-1, IL-6, IL-10 and TNF-α in DSS-induced colitis

*P<0.05vsnormal;#P<0.05vsmodel

4 讨论

IBD治疗药物包括氨基水杨酸制剂、糖皮质类激素、免疫抑制剂和各种生物制剂(如TNF-α单抗等)，这些药物长期使用会引起明显的副作用，如激素依赖、骨髓抑制和严重感染。因此，探讨更为安全有效的抗结肠炎药物是目前IBD研究的热点之一。

RvD1作为消退素家族中的一员，在体内起到重要的抗炎作用，其机制与限制中性粒细胞黏附与浸润有关[4]。相关研究证实RvD1具有改善组织炎症，保护器官功能的作用[5-6]，但RvD1抗结肠炎的具体机制尚不十分清楚。本研究结果显示，腹腔注射RvD1可明显降低实验性结肠炎小鼠的DAI和HI评分，降低结肠组织中MPO水平。同时发现RvD1具有维持肠上皮完整性和通透性的作用。表明RvD1可以有效改善实验性小鼠结肠炎的炎症损伤。另外，RvD1可以降低结肠组织中IL-1、IL-6、TNF-α水平，升高IL-10水平，发挥调节细胞因子水平的作用。

IL-1β在结肠炎症的促炎因子释放中起重要作用，可以上调IL-6、TNF-α等促炎因子的表达，扩大和加重结肠炎症损伤。NLRP3炎症小体作为IL-1β成熟释放的关键信号通路[11]，在肠道内稳态和炎症中起重要作用，有研究显示DSS可以激活巨噬细胞NLRP3炎症小体，用DSS或TNBS处理的NLRP3-/-小鼠结肠炎症减轻，结肠组织中促炎细胞因子水平较低[12-13]。本研究发现，DSS模型组中NLRP3、ASC、caspase-1 p20表达量均明显增加， IL-1β、iNOS水平增加；RvD1可以降低结肠炎小鼠结肠组织中NLRP3、ASC、caspase-1 p20、IL-1β、iNOS表达，表明RvD1具有通过抑制NLRP3炎症小体的活化，抑制促炎因子合成，改善小鼠结肠炎症的作用。目前，有关NLRP3炎症小体在实验性结肠炎中的作用存在一定争论。有研究显示，NLRP3-/-小鼠对实验性结肠炎更敏感[14-15]，原因可能为NLRP3作为先天性免疫的的重要组成部分，起到维持肠内稳态的关键作用，当NLRP3功能缺失，造成肠道微生物紊乱引起的黏膜损伤，是IBD可能的致病机制之一，经过抗生素处理的NLRP3-/-小鼠结肠炎症减轻[15]。

综上所述，本研究发现RvD1可以减轻DSS结肠炎小鼠结肠炎症的严重程度，保护肠道屏障功能，其机制可能与抑制NLRP3炎症小体活化，调控促炎细胞因子表达有关，提示RvD1可作为治疗IBD治疗的潜在候选药物。