红景天苷对CoCl2诱导PC12细胞低氧损伤的神经保护作用

杨泽霖，洪桂祝，张小琴，南丽红，黄 鑫，林 昱，唐宇恒，刘俊杰，汪旭雯，赖文芳，褚克丹

(福建中医药大学药学院，福建 福州 350122)

景天科植物红景天(RhodiolaroseaL.)是我国历史悠久的传统中药，具有益气活血、治疗胸痹心痛、中风偏瘫等功效。红景天苷是中药红景天的主要有效成分。课题组前期研究表明，红景天苷对大鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型具有神经保护作用[1-4]。在现阶段的研究中，在炎症反应中起重要作用的补体系统日益受到重视，受到过度激活的补体系统所产生的炎症效应片段，是造成脑内炎症反应损伤的主要始动因素之一[5]。来源于鼠肾上腺嗜铬细胞瘤的PC12细胞具有神经细胞的形态特征与功能，被广泛应用于神经系统疾病的研究。CoCl2是一种常用的化学性低氧模拟剂，在多种细胞中能诱导低氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)的表达，模拟缺氧状况，引起细胞缺氧、凋亡等相关反应[6]。本文主要研究红景天苷对化学低氧损伤PC12细胞中C3、Egr1、Egr4表达的影响，观察红景天苷是否能够逆转PC12细胞的神经损伤，探讨红景天苷神经保护作用的分子机制。

1 材料

1.1细胞株PC12细胞，购自中国科学院上海生命科学研究院。

1.2药品与试剂红景天苷由福建中医药大学提供，纯度≥98%；胎牛血清(HyClone，货号：SV 30087.02)；Egr1(588)抗体(货号：sc-110)、Egr4(U-25)抗体(货号：sc-133540)、C3a受体拮抗剂(C3a receptor antagonist，C3aRA)(货号：SC-222291)，均购自Santa Cruz公司；β-actin 抗体(碧云天生物技术有限公司，货号：AA128)；Egr4 siRNA(Qiagen，货号：SI01509025)；caspase-3 活性检测试剂盒(Cell Signaling Technology，货号：#5732S)；DeadEndTMFluorometric TUNEL System(美国Promega公司，货号：G3250)；RNeasy® Mini Kit(QIAGEN，货号：74104、74106)；RevertaidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas，货号：K1622)；TaqMan®Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems，货号：R11022)。

1.3仪器7900HT荧光定量PCR仪(Applied Biosystems公司)；Infinite M200 Pro多功能酶标仪(TECAN公司)；ChemiDoc XRS+凝胶成像系统(Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1细胞培养PC12 细胞接种在25 cm2细胞培养瓶中，加入含10%胎牛血清、1%青霉素、链霉素的改良型RPMI 1640培养液，置于37 ℃的细胞培养箱中培养、传代。

2.2实验分组与处理待PC12细胞处于对数生长期后，将其分为5组：正常对照组(Normal)、模型组(Model)、CoCl2+0.1 μmol ·L-1红景天苷组、CoCl2+1 μmol ·L-1红景天苷组、CoCl2+10 μmol ·L-1红景天苷组。待细胞长到80%后，吸出旧培养基，用PBS洗1遍，模型组和给药组中加入含CoCl2的培养基(CoCl2的终浓度为200 μmol·L-1)。之后给药组立即加入相应浓度的红景天苷，正常对照组加入相同的溶剂，细胞继续培养48 h，收集样品待测。

2.3caspase-3活性的检测PC12细胞以2×108·L-1的密度接种于96孔板，每孔加入100 μL，待细胞长到80%后，PBS洗1遍，经CoCl2造模、红景天苷给药处理细胞48 h后，预冷的PBS漂洗1遍，加入25 μL试剂盒中的细胞裂解液，冰上静置5 min，再加入200 μL Ac-DEVD-AMC( caspase-3四肽荧光底物)，于37 ℃ 避光孵育1 h后，在多功能酶标仪上测定荧光强度，激发波长380 nm，发射波长为420 nm，单位以相对荧光单位(relative fluorescence units，RFU) 表示。

2.4C3a受体拮抗剂实验实验分组：正常组(Normal)、正常+红景天苷(1 μmol·L-1)组、模型组(Model)、模型+红景天苷(1 μmol·L-1)组、模型+C3aRA(50 nmol·L-1)组、模型+C3aRA(50 nmol·L-1)+红景天苷(1 μmol·L-1)组。以2×108·L-1的细胞密度接种PC12细胞至24孔培养板中，每孔中加入不含抗生素的培养基0.5 mL，按照分组造模、给药后，细胞继续培养48 h后收集样品，检测Egr4、Egr1 mRNA表达及caspase-3活性。

2.5Egr4siRNA干扰实验实验分组：正常组(Normal)、模型组(Model)、siRNA阴性对照组(Negative control)、红景天苷组(Model+Salidroside组，红景天苷终浓度为1 μmol·L-1)、Egr4 siRNA组(Model+Egr4 siRNA组，Egr4 siRNA终浓度为50 nmol·L-1)、Egr4 siRNA+红景天苷组(Model+Egr4 siRNA+ Salidroside组，Egr4 siRNA终浓度为50 nmol·L-1，红景天苷终浓度为1 μmol·L-1)。转染前24 h，以2×108·L-1的细胞密度接种PC12细胞至24孔培养板中，每孔加入不含抗生素的培养基0.5 mL，使转染时的细胞密度能够达到30%～50%汇合度。按照分组造模给药，其中siRNA组加入siRNA-lipofectamineTM2000(lipo2000)混合液混匀；作用6 h后，移去含有siRNA-lipo2000混合液的培养基，更换新鲜的培养基，且同时给予红景天苷(终浓度1 μmol·L-1)，细胞继续培养48 h后收集样品，检测C3 mRNA表达，Egr4、Bax、Bcl-xl蛋白表达及caspase-3活性。

2.6Westernblot检测相关蛋白的表达提取细胞总蛋白，按照SDS-PAGE凝胶配制试剂盒说明书，配制合适浓度的分离胶。上样，电泳至蓝色带刚好跑到凝胶底部时终止电泳。转膜成功后TBS洗1遍，把PVDF膜浸泡在封闭液中，置于摇床上室温封闭2 h。加入一抗Egr1 (1 ∶800)、Egr4(1 ∶600)、C3(1 ∶600)、β-actin(1 ∶3 000)，4 ℃孵育过夜。二抗室温孵育2 h，PVDF膜用TBS洗涤(10 min×3次)，显影。

2.7qPCR法检测相关基因的表达提取细胞总RNA，逆转录成cDNA，以cDNA为模板，荧光定量PCR检测各基因的表达。PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，参照GenBank中大鼠Egr1、Egr4、C3的引物序列，Egr1引物上游序列5′-AAAATGGAATCTCTACGAAGGTCA-3′，下游序列5′-AGTCGCAGGTCAATGAAGAAGTC-3′，PCR扩增片断长度为128 bp；Egr4引物上游序列5′-AAGCTGGAGCAGGAAGAGGTTG-3′，下游序列5′-GCAGGGAGGAGGTTTTGGATAG-3′，PCR扩增片断长度为161 bp；C3引物上游序列5′-AAAATGGAATCTCTACGAAGGTCA-3′，下游序列5′-AGTCGCAGGTCAATGAAGAAGTC-3′，PCR扩增片断长度为128 bp。

3 结果

3.1红景天苷对PC12细胞低氧损伤后caspase-3活性的影响如Fig 1所示，200 μmol·L-1CoCl2处理PC12细胞48 h后，与正常组比较，模型组中caspase-3活性明显升高；经不同浓度红景天苷处理后，细胞caspase-3活性明显下降，且呈剂量依赖性，10 μmol·L-1红景天苷作用的效果最好。

3.2红景天苷对PC12细胞低氧损伤后C3蛋白表达的影响如Fig 2所示，与正常组比较，模型组中C3蛋白高表达，经不同浓度红景天苷作用后，C3蛋白表达降低，且随剂量的递增，条带的表达减弱。

3.3红景天苷对PC12细胞低氧损伤后Egr4、Egr1蛋白表达的影响与正常组比较，模型组中Egr4、Egr1蛋白表达降低，经不同浓度红景天苷作用后，Egr4、Egr1蛋白表达增加(Fig 3)。

Fig 1 Effect of salidroside on activity of caspase-3 of PC12 after CoCl2-induced hypoxia injury n=6)

*P<0.05,**P<0.01vsmodel

Fig 2 Effect of salidroside on C3 protein expression of PC12 after CoCl2-induced hypoxia injury n=6)

**P<0.01vsmodel

3.4C3aRA对PC12细胞低氧损伤后caspase-3活性、Egr4、Egr1的影响PC12细胞低氧损伤模型经C3aRA作用后，caspase-3活性降低，Egr4、Egr1 mRNA表达增加，与红景天苷的作用没有明显差异(Tab 1)。这些结果表明，C3aRA对Egr4具有调控作用，进而对PC12细胞具有保护作用。

3.5Egr4siRNA在PC12细胞低氧损伤后对caspase-3活性、C3、Egr4、Bax、Bcl-xl的影响siRNA干扰PC12细胞低氧损伤模型中Egr4的表达后，导致caspase-3活性升高，Bax蛋白增加，Bcl-xl蛋白降低；经红景天苷作用后，能逆转Egr4 siRNA所引起的基因表达的变化，但对C3没有作用(Fig 4、5)。

Tab 1 Effect of C3aRA on activity of caspase-3, Egr4 and Egr1 mRNA expression of PC12 cells after CoCl2-induced hypoxia injury (fold of normal) n=6)

**P<0.01vsmodel

Fig 3 Effect of salidroside on Egr4 and Egr1 protein expression of PC12 cells after CoCl2-induced hypoxia injury n=6)

*P<0.05,**P<0.01vsmodel

这些结果表明，Egr4对C3没有调控作用，但红景天苷能够通过调控Egr4，进而对PC12细胞发挥保护作用。

4 讨论

CoCl2诱导PC12细胞化学性低氧损伤模型，常用于神经细胞缺氧的体外研究。CoCl2能够诱导一些种类细胞里的HIF-1的表达，因此，可以作为PC12、HepG2等细胞株的化学性低氧模拟剂[7-8]。PC12细胞来源于鼠肾上腺嗜铬细胞瘤，具有神经细胞的形态特征与功能，广泛应用于神经系统疾病的研究[9-11]。CoCl2诱导的PC12化学低氧损伤模型能够模拟体内脑缺氧情况，是体外研究神经细胞缺氧的理想模型。本研究采用CoCl2诱导PC12化学性缺氧损伤发现，与正常组比较，模型组的Bax蛋白表达增加，Bcl-xl蛋白表达降低，caspase-3活性升高，经红景天苷作用后，能够逆转Bax、Bcl-xl蛋白的表达，以及caspase-3活性，表明红景天苷能抑制PC12细胞因低氧损伤而导致的细胞凋亡。

Fig 4 Effect of Egr4 siRNA on Egr4 protein expression(A) and C3 mRNA expression(B) of PC12 cells after CoCl2-induced hypoxia injury n=6)

NC: Negative control; Egr4 siRNA: Model+Egr4 siRNA; Sal: Model+Salidroside; Egr4 siRNA+Sal: Model+Egr4 siRNA+ Salidroside.*P<0.05,**P<0.01vsmodel;##P<0.01vsEgr4 siRNA.

Egr4是与神经突触可塑性相关的基因，本研究发现，Egr4 siRNA作用后，Bax蛋白表达增加，Bcl-xl表达降低，caspase-3活性升高，经红景天苷作用后，能够逆转该作用。且研究发现，Egr4 siRNA对C3作用不明显。提示红景天苷能够促进Egr4的表达，进而抑制PC12细胞因低氧损伤而导致的细胞凋亡。

补体C3是激活补体系统4条途径的共同枢纽，在激活促炎因子、诱发炎症介质释放、溶解靶细胞中扮演关键的角色。活化后的补体C3在C3转化酶的作用下，在蛋白水平酶解成具有过敏性毒素的C3a小片段和C3b，C3a进而与C3a受体结合，发挥过敏性毒素的作用，导致细胞破坏、溶解[13-14]。本研究通过使用C3aRA阻断C3a/C3aR的结合。使用C3aRA后，PC12细胞的caspase-3活性降低，与红景天苷作用相似，提示红景天苷通过抑制补体C3/C3a受体，起到抗凋亡作用。且研究发现，拮抗C3a受体作用后，对Egr4具有调控作用。

Fig 5 Effect of Egr4 siRNA on activity of caspase-3(A), Bax and Bcl-xl protein expression(B) of PC12 cells after CoCl2-induced hypoxia injury n=6)

NC: Negative control; Egr4 siRNA: Model+Egr4 siRNA; Sal: Model+Salidroside; Egr4 siRNA+Sal: Model+Egr4 siRNA+ Salidroside.*P<0.05,**P<0.01vsmodel;#P<0.05,##P<0.01vsEgr4 siRNA.

综上所述，本研究结果提示，红景天苷对CoCl2诱导PC12细胞损伤模型具有神经保护作用，与抑制补体成分C3，促进Egrs表达，进而抑制Bax蛋白表达及caspase-3的活性，促进Bcl-xl表达有关。