迷迭香酸类似物-11通过EGFR-JNK通路抑制人胃癌MGC-803细胞增殖和迁移

李婉婷，韦立群，李 清，黄道航，潘晓杭，黄俊力，甘嘉亮，唐双意

(广西医科大学1. 第一附属医院药学部、2. 药学院、3. 第一附属医院结直肠肛门外科、4. 广西生物医药协同创新中心，广西 南宁 530021)

恶性肿瘤作为仅次于心血管疾病的第二大“隐形杀手”，现今已有取而代之的趋势。据估计，到2025年，全球新增肿瘤数量将达到2 000万，严重威胁人类健康和社会经济的可持续发展[1]。有数据显示，以胃癌、肝癌、食道癌为主的消化道肿瘤依然是位居中国前五的恶性肿瘤, 因此，胃癌仍是发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一，其5年生存率低于30%[2]，寻求新的途径来治疗胃癌尤为重要。迷迭香酸(rosmarinic acid，RA)是一种天然的水溶性苯酚羧酸，化学成分主要有酚类、萜类、黄酮类等。RA的药理作用也非常广泛，包括抗癌、抗菌、抗抑郁、保护神经等[3]。房祥杰等[4]报道，RA可通过MAPK/ERK信号通路，抑制结肠癌LS174T细胞增殖，诱导细胞凋亡。杨沛霖[5]报道，迷迭香酸类似物RA-C1能剂量依赖性地抑制人鼻咽癌CNE-1细胞增殖，并诱导其凋亡。从RA多种生物学效应的理论基础出发，本研究小组合成了十几个迷迭香酸类似物(rosmarinic acid analogue，RAA)。通过前期的药效学研究发现，迷迭香酸类似物-11(rosmarinic acid analogue-11，RAA-11)在抗肿瘤方面有明显优势，其化学结构式见Fig 1。因此，本课题进一步用RAA-11作用于人胃癌MGC-803细胞，基于表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)-JNK通路，探讨其对细胞增殖、迁移及凋亡的影响，为进一步开发RAA-11提供基础。

Fig 1 The chemical structure of RAA-11

1 材料

1.1主要试剂及配制RAA-11由广西医科大学药学院李清老师合成并鉴定(纯度≥98%)，用DMSO配制成50 mmol·L-1储存液，于-20 ℃避光保存，实验时用DMEM高糖培养基或RPMI 1640培养基稀释成低、中、高浓度(10、20、40 μmol·L-1)；RPMI 1640培养基、DMEM高糖培养基，购自美国Gibco公司；南美胎牛血清，购自依科赛生物科技(太仓)有限公司；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液(含酚红)、MTT、DMSO，购自北京索莱宝科技有限公司；AxyPrepTMMultisource Total RNA Miniprep Kit购自康宁生命科学(吴江)有限公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)购自日本TaKaRa公司；EGFR mRNA、GAPDH mRNA引物，购自南京金斯瑞生物科技有限公司；EGFR、JNK、p-JNK、caspase-3、Bax、Bcl-2、GAPDH兔抗人单克隆抗体，购自沈阳万类生物科技有限公司。

1.2仪器全自动酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)；荧光倒置相差显微镜(日本尼康公司)；NanoDrop 2000分光光度计、StepOnePlusTMReal-Time PCR仪(赛默飞世尔科技有限公司)；电泳系统(美国Bio-Rad公司)；LI-COR Odyssey红外荧光扫描成像系统(美国LI-COR公司)。

2 方法

2.1细胞培养人胃黏膜上皮细胞株GES-1和人胃癌细胞株MGC-803，购于中国科学院上海细胞库。GES-1细胞用含10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM高糖培养基常规培养，MGC-803细胞用含10%胎牛血清和1%青链霉素的RPMI 1640培养基常规培养，在含有5% CO2饱和湿度的37 ℃恒温箱中培养，长满后用0.25%胰酶消化用于后续实验。

2.2MTT法常规培养人胃黏膜上皮GES-1细胞和人胃癌MGC-803细胞，收集处于对数生长期的细胞，将其密度调整为5×107·L-1，接种于96孔板，每孔100 μL。贴壁后，GES-1细胞加入200 μL用DMEM高糖培养基稀释的RAA-11(终浓度0、10、20、40、80、160 μmol·L-1)，MGC-803细胞加入200 μL用RPMI 1640培养基稀释的RAA-11(终浓度0、10、20、40、80、160 μmol·L-1)，每个浓度设置6个复孔。分别培养24、36、48 h后，每孔加入20 μL MTT，置孵箱中孵育4 h后，加100 μL DMSO并剧烈震荡10 min，用酶标仪测570 nm波长处各孔的OD值。细胞存活率=OD加药组/OD对照组×100%。

2.3划痕实验消化对数生长期的人胃癌 MGC-803细胞，用RPMI 1640完全培养基将其密度调整为1.5×108·L-1，接种到6孔板，每孔2 mL。贴壁后弃培养基，用马克笔在6孔板背面划横线，小枪头在细胞上垂直于马克笔迹划竖线。用PBS洗下划掉的细胞，每孔分别加入2 mL用RPMI 1640培养基稀释的RAA-11(终浓度0、10、20、40 μmol·L-1)，拍照0、24、36、48 h划痕宽度(L)，计算细胞迁移情况。细胞迁移率=(L0 h-Ln h)/L0 h×100%，n=24、36、48。

2.4荧光实时定量PCR(qRT-PCR) 消化对数生长期的MGC-803细胞，接种于25 cm2培养瓶中，待其长到80%～90%左右，每瓶分别加入3 mL用RPMI 1640培养基稀释的RAA-11(终浓度0、10、20、40 μmol·L-1)。药物作用48 h后，收集细胞上清液，并消化贴壁细胞，按照试剂盒说明书提取MGC-803细胞总RNA，检测RNA浓度后置于-80 ℃保存。按照说明书进行逆转录，扩增。EGFR引物序列：Forward 5′-CCTGGTCTGGAAGTACGCAG-3′，Reverse 5′-CGATGGACGGGATCTTAGGC-3′；内参GAPDH引物序列：Forward 5′-GTCTTCACCACCATGGAGAAG-3′，Reverse 5′-GTTGTCATGGATGACCTTGGC-3′。实验结果通过相对定量方法分析，计算2-ΔΔCt值，比较组间基因表达水平是否具有统计学意义。

2.5Westernblot检测消化对数生长期的人胃癌MGC-803细胞，接种于25 cm2培养瓶中，待其长到80%～90%左右，每瓶分别加入用RPMI 1640培养基稀释的RAA-11(终浓度0、10、20、40 μmol·L-1)3 mL。药物作用48 h后，收集细胞上清液，并消化下贴壁细胞，加细胞裂解液(RIPA ∶PMSF ∶Cocktail=100 ∶1 ∶1)于冰上裂解10 min，4 ℃、12 000 r·min-1离心30 min。上清液用BCA法测定蛋白浓度后，加上样缓存液煮沸变性10 min。取30 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，蛋白转移至PVDF膜上，TBST洗膜3次，5% BSA室温封闭30 min，一抗4 ℃孵育36 h。二抗室温避光孵育1 h，TBST避光洗膜3次后，于Odyssey红外荧光扫描成像系统上机扫膜，计算灰度值后分析数据。

3 结果

3.1RAA-11对GES-1细胞和MGC-803细胞增殖的抑制作用如Fig 2所示，与GES-1细胞相比，RAA-11能明显抑制MGC-803细胞的增殖，且呈时间浓度依赖性，提示RAA-11对MGC-803细胞有选择作用。线性回归得到RAA-11作用GES-1细胞24、36、48 h的IC50分别是289.425、220.430、189.521 μmol·L-1；作用MGC-803细胞24、36、48 h的IC50分别是72.781、59.979、40.625 μmol·L-1。

Fig 2 Effect of RAA-11 on survival rate at different concentrations at different

A:Human gastric mucosa cells GES-1; B:Human gastric cancer cells MGC-803.

3.2RAA-11对MGC-803细胞迁移的抑制作用如Fig 3所示，实验各组在0 h时，划痕宽度基本接近(P>0.05)。随着时间的推移(24、36、48 h)，与对照组相比，MGC-803细胞的迁移率随着RAA-11浓度增加明显降低(P<0.01)，且呈时间浓度依赖性。提示RAA-11可抑制人胃癌MGC-803细胞的迁移能力。

3.3RAA-11对MGC-803细胞EGFRmRNA表达的影响如Fig 4所示，RAA-11作用于MGC-803细胞48 h后，与对照组相比，EGFR mRNA表达明显下调(P<0.01)。结果提示RAA-11抑制MGC-803细胞的增殖和迁移可能与EGFR基因有关。

3.4RAA-11对MGC-803细胞凋亡相关蛋白表达的影响如Fig 5所示，与对照组比较，RAA-11作用于MGC-803细胞48 h后，促凋亡蛋白caspase-3和Bax表达增加，同时抑凋亡蛋白Bcl-2表达明显降低，表明RAA-11可诱导MGC-803细胞的凋亡。

Fig 3 Effect of RAA-11 on migration rate of human gastric cancer MGC-803 cells at different concentrations at different

**P<0.01vs0 μmol·L-1group

Fig 4 Effect of different concentrations of RAA-11 on expression level of EGFR mRNA in human gastric

**P<0.01vs0 μmol·L-1group

3.5RAA-11对MGC-803细胞EGFR-JNK通路蛋白表达的影响如Fig 6所示，与对照组比较，RAA-11作用于MGC-803细胞48 h后，通路蛋白EGFR明显下调，JNK、p-JNK表达明显上升。提示RAA-11可能通过作用EGFR-JNK通路，抑制MGC-803细胞增殖和迁移，并诱导其凋亡。

Fig 5 Effect of different concentrations of RAA-11 on expression of apoptosis related proteins in human

**P<0.01vs0 μmol·L-1group

Fig 6 Effect of different concentrations of RAA-11 on expression of EGFR-JNK pathway proteins in human

**P<0.01vs0 μmol·L-1group

4 讨论

与坏死不同，细胞凋亡(或称程序性细胞死亡)是细胞与生俱来的一种机制，借此机体可去除不需要的细胞[6]。caspases是细胞凋亡的重要介导因子，caspase-3作为caspases家族执行阶段的关键因子，在细胞凋亡过程中起着至关重要的作用，有研究证实，caspase-3在人肿瘤组织和细胞系中存在突变[7]。其下游因子Bcl-2是一种癌基因，可分为抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。在各种凋亡刺激下，促凋亡蛋白Bax通过诱导线粒体外膜通透性和释放凋亡所需的可溶性因子，触发内在凋亡通路[8]。本实验结果显示，RAA-11能够抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，同时促进凋亡启动因子caspase-3以及促凋亡蛋白Bax的表达，所以我们认为RAA-11可以诱导人胃癌MGC-803细胞凋亡。

EGFR又称ERBB1和HER1，是一种跨膜酪氨酸激酶受体。EGFR是人类表皮受体(HER)家族的一员，是细胞信号通路的重要组成部分[9]。研究表明，抑制EGFR信号通路可诱导癌细胞增殖、迁移和细胞衰老[10]，EGFR在肿瘤生长中起着至关重要的作用[11]。EGFR通常位于细胞膜表面，当受到某些刺激时，可以激活它位于细胞内的激酶通路，诱导其下游通路的磷酸化，包括MAPK、Akt、STAT3通路,促进细胞生长、增殖。本实验结果显示，RAA-11从基因和蛋白水平均下调了EGFR的表达，表明RAA-11抑制MGC-803细胞的增殖和迁移，并诱导其凋亡与EGFR通路有关。

JNK是丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族的成员之一，其中JNK家族包括10个由3个基因编码的亚型:JNK1(4个亚型)、JNK2(4个亚型)和JNK3(2个亚型)。JNK1和JNK2存在于身体的所有细胞和组织中，而JNK3主要在心脏、大脑和睾丸中表达。众多研究表明，JNK在炎症、凋亡、坏死信号通路的调控中发挥重要作用[12]。JNK诱导MGC-803细胞凋亡可能是通过线粒体途径发挥作用，诱导细胞色素释放入细胞质内，既可促进多种凋亡蛋白的表达，又可作用于Bcl-2家族中促凋亡蛋白Bax、Bak等，从而启动细胞凋亡的途径[13]。本实验结果显示，RAA-11明显下调了通路蛋白EGFR的表达水平，并上调了通路蛋白JNK、p-JNK的表达量，我们猜想RAA-11可能通过EGFR-JNK通路来抑制人胃癌MGC-803细胞增殖和迁移，并诱导其凋亡。

综上所述，本实验表明RAA-11对人胃癌MGC-803细胞的增殖、迁移有明显的抑制作用，并能够诱导其凋亡，机制可能与EGFR-JNK通路有关。结合前期研究，我们认为RAA-11通过多条通路对人胃癌MGC-803细胞发挥抗肿瘤效应。

(致谢：本文实验在广西医科大学科技楼基础实验室完成，由衷感谢各位老师和同学的帮助！)