HPLC-ESI-ITMS法分析蜜炙前后款冬花中毒性成分克氏千里光碱的变化

吴 笛， 雷 昌， 唐 林

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410007；2.湖南省中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室培育基地，湖南长沙410208）

吡咯里西啶生物碱 （pyrrolizidine alkaloids）是一类由植物合成的天然有机化合物。迄今已发现400多个不同结构的吡咯里西啶生物碱，存在于世界各地6 000多种有花植物中，这些植物多集中于菊科、紫草科、豆科、兰科。在已发现的吡咯里西啶生物碱中，约半数对人类和动物有毒，其毒性作用主要表现为肝脏毒性、肺脏毒性、基因毒性、致癌作用、神经毒性。因服用含吡咯里西啶生物碱的草药、补剂、茶，或间接的食物污染 ［如蜂蜜、牛奶或肉类 （因动物摄取含吡咯里西啶生物碱的花蜜、牧草而蓄积毒性）等］导致人畜中毒的事件在许多国家均有报道［1］。

款冬花为菊科植物款冬Tussilago farfara L.的干燥花蕾，为常用中药材，具有润肺下气、止咳化痰之功效。款冬含有微量的吡咯里西啶生物碱，1976年以来从中陆续检测或分离得到几种毒性和非毒性的吡咯里西啶生物碱［2-5］，其中克氏千里光碱是一种典型的毒性吡咯里西啶生物碱，是款冬中最主要的该类成分［5］。本课题组曾针对款冬花中的吡咯里西啶生物碱进行植化分离，成功分离得到克氏千里光碱，但没有分离得到其他吡咯里西啶生物碱［6］。中医认为，炮制可增强药物的效用、减轻或消除药物的毒性或副作用，款冬花临床多用蜜炙品 （蜜款冬花），但蜜炙对其是否具有减毒作用目前尚无定论。

基于上述原因，本课题组认为有必要针对款冬花中的毒性吡咯里西啶生物碱开发一种简便、准确的定量分析方法，通过比较蜜炙前后款冬花中毒性吡咯里西啶生物碱的含有量，分析蜜炙对其是否具有减毒作用。针对款冬 （包括花蕾、花、叶）中吡咯里西啶生物碱定量分析的不足之处在于，采用杂质干扰大、准确度低的比色法检测总生物碱的含有量，结果准确性存疑［7-8］；或所建立的定量分析方法灵敏度不高，样品处理方法复杂，不利于操作［9-12］。

基于款冬花中吡咯里西啶生物碱的低含有量 （约为0.015%）［2］及液质联用 （LC-MS） 技术的高灵敏度，本研究拟采用高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用 （HPLC-ESI-ITMS）技术，针对款冬花中的微量毒性成分克氏千里光碱建立一种简便快速、准确灵敏的含有量测定方法，考察蜜炙前后其变化，分析蜜炙对款冬花是否具有减毒作用。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Surveyor LC系统、LCQ DECA XPplus质谱仪（包括电喷雾离子源和离子阱质量分析器）、仪器控制和数据采集处理软件 （Xcalibur1.3工作站） （美国 Thermo Finnigan公司）；TSKgel ODS-100S柱 （250 mm ×2.0 mm，5 μm，日本Tosoh公司）；KQ-500B型医用数控超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）；AE200型分析天平 （万分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；BP211D型分析天平（十万分之一）、PB-10型酸度计 （德国Sartorius公司）。

1.2 材料 款冬花采集于国内各主要产区，经湖南中医药大学第一附属医院吴笛鉴定为菊科植物款冬Tussilago farfara L.的干燥花蕾。蜜款冬花的制备按照2015年版《中国药典》一部款冬花项下相关要求及四部规定的蜜炙法进行［13-14］。药材和蜜炙品在60℃下干燥后，粉碎成细粉（过3号筛）。

克氏千里光碱对照品为自制，结构经NMR和MS鉴定，纯度经HPLC、LC-MS检测其含有量大于98%；乙腈为色谱纯，购于美国Fisher公司；96%甲酸为色谱纯，购于美国Tedia公司；其他试剂均为分析纯；水为纯净水，购于杭州娃哈哈集团有限公司。

2 方法与结果

2.1 分析条件 TSKgel ODS-100S柱 （250 mm×2.0 mm，5 μm）； 流动相乙腈-0.2%甲酸 （18∶82）； 体积流量0.2 mL／min； 柱温 25℃； 进样量 2 μL； 电喷雾离子化（ESI）；正离子模式；雾化气 （氮气）压力220.64 kPa；辅助气 （氮气）压力68.95 kPa；喷雾电压5 kV；毛细管温度300℃；毛细管电压9 V；选择克氏千里光碱的2个二级离子m／z 168、150作为定量分析离子。

2.2 对照品溶液制备 取克氏千里光碱对照品适量，精密称定，加0.1%盐酸制成每1 mL含100 μg该成分的溶液，作 为 贮 备 液， 分 别 稀 释 至 200、 100、 50、 10、 1、0.5 ng／mL， 即得。

2.3 供试品溶液制备 取药材粉末0.5 g，精密称定，加入50 mL 0.1%盐酸超声15 min，取出，0.1%盐酸补足减失的质量，过滤，取续滤液，0.1%盐酸稀释10倍，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.4 线性关系考察、最低检测限 （LOD）和最低定量限（LOQ） 取 “2.2”项下贮备液，分别稀释至1 000、500、200、 100、 50、 10、 1、 0.5 ng／mL， 在 “2.1” 项条件下进行分析。以对照品质量浓度为横坐标 （X），相应的峰面积为纵坐标 （Y）进行回归，逐步稀释对照品溶液，按信噪比3和10分别计算LOD和LOQ，得回归方程Y＝354 278X＋868 320 （R2＝0.997 2）， 在 0.5～200 ng／mL 范围内线性关系良好， LOD 为100 pg／mL， LOQ 为500 pg／mL。

2.5 精密度试验

2.5.1 日内精密度 每3 h 1次，取10、100、200 ng／mL对照品溶液在 “2.1”项条件下连续进样5次，测得峰面积的RSD分别为1.96%、1.65%、0.91%，表明仪器日内精密度良好。

2.5.2 日间精密度 1次／d， 取10、 100、 200 ng／mL对照品溶液在 “2.1”项条件下连续进样5 d，测得峰面积的RSD分别为2.08%、2.43%、1.99%，表明仪器日间精密度良好。

2.6 重复性试验 取同一样品6份，每份0.5 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在 “2.1”项条件下进样，测得克氏千里光碱含有量RSD为2.31%，表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 取 “2.6”项下同一供试品，在 “2.1”项条件下于0、6、12、24、48 h连续进样5次，测得克氏千里光碱峰面积RSD为2.08%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验 取含有量已知的同一批样品0.25 g，精密称定，精密加入高、中、低3个剂量的克氏千里光碱对照品，共9份，按 “2.3”项下方法制备供试品溶液，在 “2.1”项条件下进样，结果见表1。

表1 克氏千里光碱加样回收率试验结果 （n＝9）

2.9 样品含有量测定 取药材和蜜炙品 （蜜炙品取样量折算成对应药材量），按 “2.3”项下方法制备供试品溶液，在 “2.1”项条件下进样，计算含有量，结果见表2。

表2 克氏千里光碱含有量测定结果 （μg／g，±s， n＝3）

表2 克氏千里光碱含有量测定结果 （μg／g，±s， n＝3）

注：a为样品1的蜜炙品，b为样品4的蜜炙品，c为样品7的蜜炙品

编号 来源 采集时间 含有量1 河北蔚县 2016-12 88.35±0.62 2a — — 57.60±1.28 3a — — 59.11±0.80 4 山西广灵 2016-12 67.52±0.95 5b — — 56.04±2.36 6b — — 53.66±1.77 7 甘肃陇西 2017-01 102.33±1.84 8c — — 80.27±0.24 9c — — 78.56±1.73 10 甘肃渭源 2017-01 93.02±2.26 11 甘肃灵台 2017-01 77.43±0.83 12 山西沁源 2017-02 70.55±0.95 13 重庆巫溪 2017-04 52.66±2.73 14 河南洛阳 2017-11 45.38±1.90

3 讨论

3.1 流动相优化 酸性流动相条件下生物碱在质谱仪中更易离子化，一般生物碱的检测均选择正离子模式。考察了酸性流动相条件下不同pH对克氏千里光碱色谱行为的影响，结果表明流动相pH越低，克氏千里光碱峰形越好，随着pH升高，拖尾现象逐渐严重；3个pH （2.5、3.0、3.5）中，pH2.5时峰形最好，pH3.5时拖尾严重。同时考察了乙腈-甲酸水、甲醇-甲酸水系统对克代千里光碱色谱行为的影响，结果表明前者较后者分离效果更好，峰形更锐。经比较，选择乙腈-0.2%甲酸 （pH 2.5）作为流动相。3.2 定量分析离子选择 克氏千里光碱的二级质谱显示有3个特征碎片离子，即m／z 168、150、122，见图1。为提高检测灵敏度，同时选择丰度较高的二级离子m／z 168、150作为定量分析离子。

图1 样品分析图谱

3.3 提取程序优化 重点考察了不同溶剂、提取方法对克氏千里光碱提取效率的影响。考虑到指标成分为生物碱，在考察提取溶剂时选择了不同浓度的酸性溶液，结果表明，以50 mL 0.1%盐酸为溶剂超声15 min时，提取效率较高。

3.4 杂质峰 款冬花供试品溶液的选择离子色谱图及二级离子色谱图 （图1）均显示有一较小杂质峰，表明尚含有克氏千里光碱的同分异构体，且具有相同的特征碎片离子m／z 168、150，但含有量远低于克氏千里光碱。文献［5］报道款冬含有新克氏千里光碱，为克氏千里光碱的同分异构体 （仅C15、C20间双键构型不同，克氏千里光碱为Z构型，新克氏千里光碱为E构型），推测此杂质峰即为新克氏千里光碱。因缺乏新克氏千里光碱的对照品，此杂质峰的归属有待进一步确证。

3.5 克氏千里光碱线性范围 克氏千里光碱在0.5～200 ng／mL的质量浓度范围内线性关系较好，质量浓度高于500 ng／mL时变差，即质量浓度越高线性关系越差，具体原因有待深入探讨。因此，在制备供试品溶液时，提取液过滤后取续滤液，用0.1%盐酸稀释10倍，以供LC-MS进样分析。

3.6 克氏千里光碱含有量测定 不同产地款冬花中克氏千里光碱含有量差别较大，这可能与其不同的生长环境有关；蜜炙品中克氏千里光碱含有量均显著低于对应药材，表明蜜炙可一定程度上降低其含有量，这可能是在蜜炙的高温炒制过程中该成分部分分解或发生其他化学反应所致，表明蜜炙对款冬花可能具有一定的减毒作用，具体原因有待深入研究。

2015年版 《中国药典》一部收载了数种含有毒性吡咯里西啶生物碱的药材，如千里光、野马追、款冬花、紫草，并涉及数十种成方制剂，且大多数品种缺乏对此类成分的安全限量规定，其潜在的用药风险可能被忽视。基于对中药安全性问题的重视及降低可能药物不良反应和用药风险的考虑，有必要开展相关基础研究，进行毒性评价，并在此基础上对含有毒性吡咯里西啶生物碱的中药加强质量控制，设定安全限量。本实验采用HPLC-ESI-ITMS技术针对款冬花中主要毒性成分克氏千里光碱建立了定量分析方法，该方法简便快速、准确灵敏，可为该药材质量标准的完善提供参考。