竹节参总皂苷对衰老大鼠结肠炎症反应的改善作用

程志豪， 顿耀艳， 刘 洁， 李玉婷， 郭煜晖， 何毓敏， 袁 丁， 张长城∗

（1.三峡大学医学院，湖北宜昌443002；2.三峡大学仁和医院，湖北宜昌443002）

随着老年人口占总人口比例越来越大，其健康问题逐渐受到人们关注。肠道在机体内的主要功能是吸收营养物质、阻挡细菌等有害物质进入机体，增龄过程中肠道炎症反应可使其黏膜屏障功能受损，肠道内细菌容易移位进入机体多个系统，从而导致机体长期处于慢性炎症反应状态，引发肠内外多种疾病［1］。

在衰老过程中，老年人随着年龄增加容易出现营养不良、便秘、大小便失禁，而衰老引起的肠道免疫系统 （如胃肠道黏膜层受损）可能增加年龄相关感染性疾病的发生率和严重程度［2］。肠上皮细胞在肠道黏膜屏障中具有重要作用，可识别细菌、病毒等有害物质，并产生免疫反应；TLR4在固有免疫系统中有重要作用，可识别革兰氏阴性菌脂多糖，介导MyD88途径和非依赖性MyD88途径［3］。研究表明，降低肠黏膜TLR4表达时，机体免疫球蛋白A（IgA）分泌减少，肠黏膜免疫屏障受损，抗细菌侵袭能力减弱，进而导致细菌易位［4］；课题组前期研究发现，衰老大鼠小肠上皮内的淋巴细胞和杯状细胞减少，肠黏膜免疫能力下降［5］，并且在衰老过程中大鼠结肠屏障功能减弱，炎症因子IL-1β、TNF-α等表达增加［6］，但衰老大鼠结肠炎症反应是否与TLR4信号通路介导的免疫功能减弱相关尚不明确。

竹节参为五加科人参属植物竹节参Panax japoni-cus C.A.Mey的干燥根茎，是一种常见中草药，皂苷类为其主要的药效物质基础。课题组前期研究显示，竹节参总皂苷可降低非甾体抗炎药引起的肠损伤［7］，改善环磷酰胺导致小鼠免疫功能降低［8］；本实验主要研究该成分对衰老大鼠结肠炎症反应的改善作用。

1 材料

1.1 动物 48只SPF级SD雄性大鼠，购自三峡大学医学院实验动物中心，实验动物生产许可证号SCXK（鄂）2011-0061。

1.2 试药 竹节参采自湖北省恩施州椿木营竹节参种植基地，经三峡大学生物与制药学院邹坤教授鉴定为五加科植物竹节参Panax japoni-cus C.A.Mey的干燥根茎，将干燥药材制成粉，60%乙醇加热回流提取，合并滤液，浓缩干燥后得到总皂苷提取物，采用香草醛-高氯酸比色法 （以人参皂苷Re为对照品）测得其含有量为67.66%。RNA逆转录试剂盒 （日本 TaKaRa公司）；β-actin、IL-6、IL-23引物（生工生物工程有限公司），序列见表 1；一抗 TLR4、TRAF6（美国Santa Cruz公司）。

表1 引物序列

1.3 仪器 EG1150H石蜡包埋机、TP1020脱水机、Ultracutr超薄切片机 （德国Leica公司）；CX41光学倒置显微镜 （日本Olympus公司）；VeritiTM96-Well Thermal Cycler梯度PCR仪 （德国Applied Biosysterms公司）；1-15 K离心机 （美国Sigma公司）。

2 方法

2.1 分组及给药 大鼠随机分为青年组 （6月龄）、自然衰老组 （24月龄）［6］及竹节参总皂苷低、高剂量组，每组12只；取36只给予正常饲料的18月龄大鼠，随机分为自然衰老组及竹节参总皂苷低、高剂量组，其中自然衰老组给予正常饲料至24月龄，竹节参总皂苷低、高剂量组通过饲料连续给予10、30 mg／kg竹节参总皂苷6个月，每天1次；取12只6月龄大鼠作为青年组。24月龄时给药结束，称量并记录每只大鼠体质量，10%乌拉坦麻醉，固定在鼠板上，剪开腹部取血后分离肠道组织，取新鲜结肠组织2 cm左右，立即放入包埋盒并投入4%多聚甲醛，剩下结肠组织剪开，生理盐水清洗粪便后立即置于－80℃冰箱中保存。

2.2 阿利新蓝、高碘酸-Schiff试剂 （PAS）染色 4%多聚甲醛固定24 h后，更换75%酒精，常规脱水、包埋，连续切片 （4 μm），经冷水、45℃热水摊片后黏附于载玻片上，60℃下烘烤4 h。阿利新蓝染色：常规脱蜡后用蒸馏水冲洗，然后甩干液体，立即滴加阿利新蓝染液，孵育5 min，蒸馏水冲洗干净，甩干后每个组织上滴加1滴核固红染液，室温下孵育2 min，流水冲洗后吹干封片；PAS染色：常规脱蜡后用蒸馏水冲洗，然后甩干每张玻片上的蒸馏水，滴加高碘酸染液孵育10 min，流水冲洗后，甩干组织上水分，滴加1滴雪夫试剂，避光孵育10 min，流水冲洗，滴加苏木素染液1 min，流水冲洗，吹干封片。显微镜取图，每组随机取5只大鼠，每只结肠各取3张不连续切片，阿利新蓝、PAS染色计算结肠组织10个隐窝杯状细胞数量，计算平均值。

2.3 免疫组织化学法 结肠组织脱水包埋后石蜡切片，每张组织切片厚度4 μm，经冷水、45℃热水摊片后60℃下烘烤4 h。常规脱蜡后蒸馏水浸泡3 min，配制柠檬酸盐修复液高压修复6 min，自然冷却至室温，PBS冲洗3次，每次5 min，甩干后滴加3%H2O2，37℃下孵育10 min，PBS冲洗3次，每次5 min，甩干水分后每个组织滴加1滴5%BSA，室温下封闭1 h，PBS冲洗干净后置于一抗湿盒中，4℃下孵育过夜，PBS冲洗，二抗室温下孵育1 h，PBS冲洗，甩干后临时用蒸馏水配制DAB显色，显色完成后流水冲洗，甩干后滴加苏木素40 s，盐酸酒精分化1 s，流水冲洗后脱水，风干封片。

2.4 RT-PCR法 称取适量新鲜结肠组织，提取组织中总RNA，并用DEPC水溶解，核酸测定仪测定RNA浓度及D（λ）260nm／D（λ）280nm， 重复 1 次， 2 次测得的结果均在 1.8～2.2范围内，而且浓度相差不得超过20 μg／mL。逆转录后扩增，扩增反应体系总体积为25 μL（10.5 μL DEPC水，12.5 μL PCR Master mix， IL-6、 XBP1 引物正反向各0.5 μL， 1 μL cDNA 模板）； 扩增条件为 94 ℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，GOTO2 30次，72℃5 min，4℃，以β-actin为内参。配制2%琼脂糖凝胶，将扩增产物加到配制好的凝胶孔中电泳30 min，凝胶成像仪拍照保存内参和目的条带，计算光密度，通过Image J软件计算IL-6、XBP1与β-actin光密度的比值。

2.5 统计学分析 实验结果通过SPSS 18.0软件进行处理，RT-PCR、免疫组织化学法结果通过Image J软件进行处理，数据以 （±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 竹节参总皂苷对大鼠结肠杯状细胞数量的影响 图1显示，与青年组比较，自然衰老组杯状细胞数量显著减少（P＜0.05）；与自然衰老组比较，竹节参总皂苷组其数量显著增加 （P＜0.05）。

图1 竹节参总皂苷对杯状细胞数量的影响 （阿利新蓝、PAS染色，×200）（n＝6）

3.2 竹节参总皂苷对大鼠结肠组织IL-6、IL-23 mRNA表达的影响 图2显示，与青年组比较，自然衰老组IL-6、IL-23 mRNA表达显著升高 （P＜0.05，P＜0.01）； 与自然衰老组比较，竹节参总皂苷组两者mRNA表达显著降低 （P＜0.05， P＜0.01）。

图2 竹节参总皂苷对IL-6、IL-23 mRNA表达的影响 （n＝6）

3.3 竹节参总皂苷对大鼠结肠组织STAT3蛋白表达的影响 图3显示，与青年组比较，自然衰老组STAT3蛋白表达显著升高 （P＜0.01）；与自然衰老组相比，竹节参总皂苷组其蛋白表达显著降低 （P＜0.01）。

图3 竹节参总皂苷对STAT3蛋白表达的影响 （n＝6）

3.4 竹节参总皂苷对大鼠结肠组织 TLR4、MYD88、TRAF6蛋白表达的影响 图4显示，与青年组比较，自然衰老组 TLR4、MYD88、TRAF6蛋白表达显著降低 （P＜0.01）；与自然衰老组比较，竹节参总皂苷组三者蛋白表达显著升高 （P＜0.05， P＜0.01）。

4 讨论

在衰老过程中，机体肠道屏障功能和免疫功能逐渐减弱，使得机体容易长期处于慢性炎症状态，引发许多炎症和衰老相关疾病，肠道黏液屏障的重要成分黏蛋白主要由杯状细胞分泌，其减少可使肠道黏液屏障受损，从而导致肠道有害物质和微生物进入机体发生炎性反应。有研究发现，在溃疡性结肠炎患者的肠道组织中杯状细胞数减少［9］，而Gersemann等［9］报道灵长类动物肠道黏膜屏障功能发生障碍，而且炎症因子IL-1β、IL-6等表达增加，其中IL-6是一种来源于Th2细胞的炎症因子，可与其受体结合活化STAT3，后者是肠道炎症发生的重要信号分子，阻断其可抑制DSS诱导的小鼠结肠炎［10］；IL-23是一种重要的促炎因子，能作用于Th17细胞，使其分泌IL-17而导致炎症反应，在小儿炎症性肠病中表达增加［11］。本实验发现，竹节参总皂苷干预后大鼠结肠杯状细胞数显著增加，结肠组织IL-6、IL-23 mRNA及STAT3蛋白表达显著降低，表明它可增强肠道黏液屏障，减轻炎症反应。

随着机体衰老，免疫系统功能逐渐减退，机体对各种内外刺激的识别能力和处理能力也有所减弱。肠道黏膜免疫系统的主要作用是防止细菌、病毒等有害物质进入机体，而在老年人中黏膜免疫能力下降，导致胃肠道细菌和病毒感染更常见［12］。肠道上皮细胞是肠屏障的重要部分，可识别微生物等外来物质，并对其刺激作出相应反应，从而加强肠屏障功能，还可参与多种免疫反应，如果肠上皮细胞免疫功能降低，则机体更容易受到微生物感染，出现炎症反应，而肠道上皮细胞对大多数有害菌 （如革兰氏阴性菌）的识别主要通过TLR4信号通路。研究表明，TLR4／MYD88介导的免疫反应可保护肠道免受沙门氏菌感染［13］，其中Toll样受体 （TLR）是肠道固有免疫细胞上一种重要的模式识别分子受体 （PRRs）［14］，TLR4是最早发现的哺乳动物TLR，主要通过识别细菌细胞壁主要成分脂多糖 （LPS）来发挥生物学效应，其主要过程是LPS与其结合蛋白结合后转运给CD14，再转运给MD2／TLR4复合物，从而激活髓样分化因子88（MYD88）、肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）表达，研究表明，衰老小鼠腹腔巨噬细胞TLR4表达降低，而血浆炎症因子的表达明显增高［15］。肠道中多种免疫细胞均可能参与炎症反应，如辅助性T淋巴细胞17（Th17）可分泌IL-17，从而导致炎症反应，进而促进IL-6、TNF-α产生［16］，提示衰老小鼠炎症可能不是来源于肠上皮免疫细胞，而是其他免疫细胞。本实验发现，竹节参总皂苷干预后大鼠结肠组织TLR4、MYD88、TRAF6蛋白表达显著增加，表明它可改善TLR4信号通路介导的免疫系统功能降低。

综上所述，竹节参总皂苷可增强衰老大鼠肠道免疫功能，从而减轻肠道炎症反应，其机制可能与改善TLR4信号通路介导的肠道免疫功能降低有关。