不同产地天花粉中15种氨基酸的测定

龚道锋， 王甫成， 纪东汉， 秦慧欣，3

（1.安徽中医药科学院亳州中医药研究所，安徽亳州236800；2.亳州职业技术学院，安徽亳州236800；3.安徽中医药大学，安徽合肥230031）

天花粉为葫芦科植物栝楼Trichosanthes kirilowii Maxim.或双边栝楼Trichosanthes rosthornii Harms的干燥根，始载于 《神农本草经》，列为中品，具有清热生津、消肿排脓的功效，常用于热病烦渴、肺燥咳血、疮疡肿毒等症［1-3］，主要含有氨基酸、蛋白质、皂苷和糖类等有效成分［4-5］。

天花粉中大量的氨基酸类成分对其质量评价具有重要意义［6-7］，但2015版 《中国药典》 （一部）仅以瓜氨酸为指标性成分进行薄层色谱定性鉴别，测定成分单一，缺乏多指标成分评价天花粉药材质量。同时通过调研发现市场流通天花粉主要产地来源为安国和亳州，安国产天花粉价格较高，普遍认为质量较好，但缺乏相应的研究支撑。据此，本研究建立柱前衍生HPLC法同时测定天花粉中15种游离氨基酸，并结合主成分分析评价安国和亳州天花粉的质量，为其质量标准提升和临床用药提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Angilent Technologies 1260 Infinity（美国安捷伦公司）；Ultimate Amino Acid柱 ［4.6 mm×250 mm，5 μm，月旭科技 （上海）股份有限公司］；岛津AU-220D电子天平 （十万分之一，上海菁海仪器有限公司）；KQ-500E型超声波清洗器 （昆山市超生仪器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式多用真空泵 （郑州市巩义华玉仪器厂）；PH计 （数显精度0.01，上海仪电科学仪器股份有限公司）。

1.2 试药 15种氨基酸 （批号140624-201506）分别为门冬氨酸 （Asp）、谷氨酸 （Glu）、丝氨酸（Ser）、 甘氨酸 （Gly）、 组氨酸 （His）、 精氨酸（Arg）、 丙氨酸 （Ala）、 脯氨酸 （Pro）、 酪氨酸（Tyr）、 缬氨酸 （Val）、 异亮氨酸 （Ile）、 亮氨酸（Leu）、 苯丙氨酸 （Phe）、赖氨酸 （Lys）、瓜氨酸（Cit） （中国食品药品检定研究院）；乙腈 （色谱纯，默克股份两合公司）；三水合乙酸钠 （分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；NaOH（分析纯，天津市光复科技发展有新公司）；冰乙酸 （分析纯，aladdin）；三乙胺 （分析纯，山东西亚化学工业有限公司）；异硫氰酸苯酯 （分析纯，山东西亚化学工业有限公司）；正己烷 （色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；实验用水均为纯化水。

实验用天花粉药材来源于安国和亳州，由亳州职业技术学院刘耀武教授鉴定为葫芦科植物栝楼Trichosanthes kirilowii Maxim.的干燥根。信息见表1。

2 方法［8-13］与结果

2.1 标准溶液制备 精密称取15种氨基酸对照品适量，加水超声溶解，制备成各氨基酸含有量均为12.5 μmol／mL的混合标准贮备溶液。另精密量取混合标准贮备溶液1 mL，用纯化水定容至5 mL，作为混合标准溶液备用。

2.2 供试品溶液制备 精密称取24批天花粉样品粉末各3 g置于锥形瓶中，加10 mL蒸馏水后封口，超声处理30 min，离心机处理10 min，过滤，滤液用蒸馏水定容至10 mL，即得。

2.3 衍生化试剂制备 衍生化试剂A，量取异硫氰酸苯酯1.2 mL，加乙腈定容至100 mL，制成0.1 mol／L异硫氰酸苯酯乙腈溶液；衍生化试剂B，量取三乙胺14 mL，加乙腈定容至100 mL，制成1 mol／L三乙胺乙腈溶液。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2.4 衍生化反应 精密量取混合标准溶液、供试品溶液和水各320 μL，分别加入衍生试剂A溶液200 μL，再加入衍生试剂B溶液200 μL，使其充分混合，室温下反应60 min，加入正己烷溶液800 μL，振荡5～10 s后室温静置使其分层，精密量取下层200 μL溶液，加入800 μL的水混合均匀，再取200 μL加入800 μL水混合均匀，用孔径为0.22 μm的有机滤膜过滤，即得混合标准溶液、供试品溶液和空白的衍生化溶液。

2.5 色谱条件 Ultimate Amino Acid色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）； 流动相 A （乙腈 ∶水＝80∶20） -B （0.1 mol／L乙酸钠溶液 ∶乙腈＝93∶7）， 梯度洗脱； 柱温 40 ℃； 体积流量1.0 mL／min； 检测波长254 nm； 进样量10 μL。 洗脱程序见表2。色谱图见图1。

表2 梯度洗脱程序Tab.2 Gradient elution programs

图1 各样品HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of various samples

2.6 线性关系考察 取混合对照品母液1 mL，分别加纯化水定容至5、10、25、50、100 mL，制得各种不同浓度的氨基酸混合标准溶液，按 “2.4”项下方法进行衍生后测定，测定值以浓度为横坐标（X）、峰面积为纵坐标 （Y）进行回归，结果见表3，表明各氨基酸在各自范围内线性关系良好。

2.7 精密度试验 取氨基酸混合标准溶液，按“2.4”项下方法进行衍生后连续进样5次，记录色谱图，测得各氨基酸峰色谱面积RSD 0.08%～3.09%，表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验 取23号样品溶液，按 “2.4”项下方法进行衍生，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，测得各氨基酸峰色谱面积RSD 0.33%～3.54%，表明室温下供试品溶液在24 h内稳定性良好。

表3 各氨基酸线性关系Tab.3 Linear relationships of various amino acids

2.9 重复性试验 取23号样品5份，按 “2.2”项下方法制备供试品溶液，按 “2.4”项下方法衍生化，进样，测得各氨基酸峰面积RSD 0.17%～0.68%，各氨基酸含有量RSD 0.29%～0.75%，表明该方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验 精密称取已知含有量17号样品，共5份，各约3 g，按 “2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液160 μL，再加入 160 μL氨基酸混合标准溶液 （0.011～0.954 mg／mL），按 “2.4” 项下方法衍生化，进样，计算各氨基酸的RSD值和回收率。测得各氨基酸平均回收率 88.42% ～105%，RSD 0.34%～1.89%。

2.11 样品含有量测定 取24批天花粉样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按 “2.4”项下方法衍生化，在 “2.5”项色谱条件下进样，结果见表4。

表4 各氨基酸含有量测定结果 （mg／g，n＝3）Tab.4 Results of content determination of various amino acids （mg／g， n＝3）

3 主成分分析

鉴于24批样品中丝氨酸、组氨酸、酪氨酸、异亮氨酸等4种氨基酸检出率较低，因此选择天花粉中另外已检测的11种氨基酸进行分析。应用SPSS 23.0统计软件中的降维-因子分析对24批样品中11种氨基酸的测定数据进行主成分分析。

3.1 主成分降维分析条件检验 通过KMO和Bartelett球形度检验，结果显示KMO统计量＝0.634，Bartelett球形度检验卡方统计量＝183.347，自由度＝55，P＝0.000小于0.05，适于因子分析。

3.2 主成分筛选及其贡献率 通过主成分分析法提取11种氨基酸公因子方差，每种氨基酸信息提取率均大于0.6。主成分的特征值、贡献率见表5，从表中可知，前4个主成分的累积方差贡献率达到85.018% （大于85%），因此选择前4个主成分，代表了11种氨基酸含有量的全部信息。

表5 方差分析Tab.5 Analysis of variance

由表5可知主成分F1的特征根为4.648，方差贡献率为42.257%，另外由表6数据显示甘氨酸、瓜氨酸、丙氨酸、缬氨酸、赖氨酸在主成分F1上有较高载荷；同理，主成分 F2特征根为2.357，方差贡献率为21.431%，主要反映了精氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸的指标信息；主成分F3特征根为1.297，方差贡献率为11.793%，主要反映谷氨酸的指标信息；主成分F4特征根为1.049，方差贡献率为9.537%，主要反映门冬氨酸、脯氨酸的指标信息。

3.3 综合主成分分析 用表6中的数据除以主成分相对应的特征值开平方根得到4个主成分中每个指标对应的系数向量，见表7。将得到的系数向量与标准化后的数据相乘，得出4个主成分表达式为

F1＝0.162Z1＋0.15Z2＋0.429Z3＋0.423Z4－0.112Z5＋0.369Z6＋0.272Z7＋0.401Z8－0.01Z9＋0.221Z10＋0.392Z11；F2＝－0.261Z1－0.408Z2－0.098Z3－0.05Z4＋0.438Z5＋0.03Z6－0.023Z7＋0.126Z8＋0.548Z9＋ 0.463Z10＋0.173Z11；

F3＝0.451Z1＋0.557Z2－0.165Z3＋0.165Z4＋0.421Z5－0.176Z6－0.408Z7＋0.033Z8＋0.192Z9＋0.032Z10＋0.136Z11；

表6 主成分载荷矩阵Tab.6 Principal components matrix

F4＝0.608Z1－0.206Z2－0.114Z3－0.113Z4＋0.354Z5＋0.158Z6＋0.574Z7－0.204Z8－0.09Z9＋0.033Z10－0.173Z11； 其中 F1～F4为 4个主成分；Z1～Z10分别为样品中门冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、瓜氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸含有量的标准化数据值。

以每个主成分所对应的特征值占所提取主成分总的特征值之和的比例作为权重得到综合主成分表达式为 F合＝0.497F1＋0.252F2＋0.139F3＋0.112F4；其中F合为综合主成分。根据上述表达式计算主成分及综合主成分得分见表8。

表7 主成分系数向量值Tab.7 Vector of principal component factors

经统计，亳州产地11个样本的F合平均值为－0.688，安国产地13个样本F合平均值为0.582。应用SPSS 23.0对亳州、安国天花粉氨基酸综合主成分F合进行独立样本的t检验，结果表明安国产地天花粉氨基酸综合主成分F合明显高于亳州产地，见表9。

表8 主成分与综合主成分得分及排序Tab.8 Principal components and sort results of the samples

表9 独立样本t检验Tab.9 t-test of independent sample

4 讨论

刘文、潘健等［14-15］采用柱前衍生反高效液相色谱法分别对天花粉中瓜氨酸、γ-氨基丁酸和天门冬氨酸、谷氨酸含有量进行了测定，提供了2种氨基酸同时定量分析方法。本实验依据异硫氰酸苯酯与氨基酸反应生成苯氨基硫甲酰氨基酸衍生物在245 nm处有较好的紫外吸收的原理，选用Amino Acid色谱分析专用柱，建立了柱前衍生高效液相色谱法同时测定天花粉中15种游离氨基酸，分离度好。该方法稳定性好、精密度高，为天花粉中多指标氨基酸类成分含有量测定提供参考。

实验结果表明24批样品中均检测出瓜氨酸、精氨酸，且两种氨基酸平均含有量占氨基酸总量的86.26%。文献表明［16］瓜氨酸在防治前列腺疾病，精氨酸在维持心血管正常功能以及肥胖、糖尿病（消渴症）的治疗中发挥重要作用，故瓜氨酸、精氨酸是天花粉发挥临床药效的物质基础，因此选取瓜氨酸、精氨酸考察天花粉药材质量，对提升现行《中国药典》仅以瓜氨酸为定性分析的标准具有重要意义。

通过对天花粉中15种游离氨基酸进行主成分分析，结果表明安国产地天花粉中游离氨基酸综合主成分评分明显高于亳州产地。在 《中国药典》以氨基酸为指标性成分的背景下，分析结果与安国天花粉价格远高于亳州产地的现状存在一定的相关性，也反映出两产地天花粉的质量差异，为天花粉中药临床选用提供参考。