基于多元统计分析的不同产地莪术饮片质量评价

顾丽亚， 胡 玮， 陆兔林，2∗， 郝 敏， 毛春芹∗， 季 德，2

（1.南京中医药大学药学院，江苏南京210023；2.江苏省中药炮制重点实验室，江苏南京210023）

莪术来源于姜科植物蓬莪术Curcuma phaeocaulis Valeton、广西莪术Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang或温郁金Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根茎，具有行气破血、消积止痛的功效［1］。现代研究表明莪术具有广泛的药理活性，包括抗炎、抗肿瘤、抗癫痫和抗菌等［2-9］，倍半萜和姜黄素类成分是其发挥药理作用的主要物质基础。文献表明不同产地土壤、光照、水分、温度等环境因素有差异，造成中药次生代谢产物积累不同，影响药材品质，进而导致中药饮片质量不一［10-11］。莪术主产于广西、四川、浙江等地［12］，作为临床常用的中药饮片，其品质好坏关系到用药的安全性和有效性。在质控方面，2015版 《中国药典》仅以挥发油得率为评价指标，不能全面评价莪术饮片的质量。目前，关于莪术饮片质量分析的文献较多，但研究主要针对莪术饮片炮制前后化学成分变化情况，不同产地各自收集的批次较少，不具有统计学意义［13-14］。

本实验采用HPLC法测定了30批不同产地莪术饮片中5个倍半萜类成分 （β-榄香烯、呋喃二烯、吉马酮、莪术醇、莪术二酮）和3个姜黄素类成分 （双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素）的含有量，结合聚类分析 （HCA）［15］、主成分分析 （PCA）［16-17］和正交偏最小二乘法（O2PLS-DA）［18］等多元统计分析方法，筛选出不同产地莪术饮片化学成分差异的标志性成分，系统、客观地评价质量差异，为其临床用药提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1260型高效液相色谱仪 （美国安捷伦公司）；HL-350 A型高速多功能粉碎机 （上海塞耐机械有限公司）；FA1104型电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）；Mettler AG285电子分析天平 （瑞士梅特勒-托利多集团）；KQ-500E型医用超声清洗器 （昆山超声仪器有限公司）。

1.2 试剂与试药 β-榄香烯对照品 （批号170802）、呋喃二烯对照品 （批号170510）、莪术醇对照品 （批号170515）均购于南京森贝伽生物科技有限公司；吉马酮对照品 （批号lw17040709）、莪术二酮对照品 （批号lw17101103）、姜黄素对照品 （批号lw17091410）、去甲氧基姜黄素对照品 （批号lw16090803）、双去甲氧基姜黄素对照品 （批号lw16090905）均购于南京良纬生物科技有限公司。乙腈 （色谱纯，德国Merck公司）；甲醇 （色谱纯，山东禹王和天下新材料有限公司）；甲酸 （色谱纯，美国Anaqua chemicals supply公司）；无水乙醇 （分析纯，无锡市亚盛化工有限公司）；Milli-Q超纯水 （南京汉隆实验器材有限公司）。

30批莪术饮片中，20批购于不同饮片生产企业，10批由浙江省瑞安市通明温郁金专业合作社提供药材，自行炮制。经南京中医药大学药学院陆兔林教授鉴定，植物基原分别为蓬莪术Curcuma phaeocaulis、广西莪术Curcuma kwangsiensis S.G.lae et C.F Liang或温郁金Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根茎。分别取净莪术参照2015版 《中国药典》制得浙江产地的莪术饮片。信息见表1。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent pro shell C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）； 流动相0.5‰甲酸乙腈（A） -0.5‰甲酸水 （B）， 梯度洗脱 （0～10 min，40%～50%A；10～20 min，50% ～75%A；20～25 min，75% ～95%A； 25～30 min， 95%A； 30～35 min，95% ～40%A； 35～40 min， 40%A）； 柱温30℃； 体积流量 1 mL／min； 检测波长 216、415 nm；进样量10 μL。色谱图见图1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取β-榄香烯、呋喃二烯、吉马酮、莪术醇、莪术二酮对照品适量，加甲醇定容，分别配制成质量浓度为 2.714、0.508、 0.254、 0.496、 0.601 mg／mL 的倍半萜类混合对照品贮备液；精密称定双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素对照品适量，加甲醇定容，分别配制成质量浓度为 0.011、0.051、0.071 mg／mL的姜黄素类混合对照品贮备液。

2.2.2 供试品溶液制备 取莪术饮片适量，粉碎，过3号筛，精密称取0.5 g粉末，置于50 mL具塞锥形瓶中，加入20 mL的70%乙醇，称定质量，超声30 min（功率250 W，频率20 kHz），补足减失质量，过0.45 μm微孔滤膜。

2.3 方法学考察

图1 各样品HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various samples

2.3.1 线性关系考察 依次精密吸取0.2、0.4、1.0、2.0、5.0 mL的混合对照品贮备液于10 mL量瓶内，加甲醇定容，制得系列对照品溶液。每个质量浓度分别进样2次，以峰面积平均值为纵坐标（Y），对照品质量浓度为横坐标 （X），进行回归，结果见表2。

2.3.2 精密度试验 精密吸取上述对照品溶液10 μL，连续进样 6次， 测得 β-榄香烯、 呋喃二烯、吉马酮、莪术醇、莪术二酮、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素峰面积RSD值分别为0.89%、0.22%、0.27%、0.88%、0.83%、0.92%、1.15%、0.64%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 选择同一批莪术粉末 （S3），平行6份，按 “2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在 “2.1” 项色谱条件下进样，测得 β-榄香烯、呋喃二烯、吉马酮、莪术醇、莪术二酮、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素质量浓度RSD值分别为1.46%、0.37%、0.72%、1.56%、1.39%、0.93%、1.88%、1.05%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 选择供试品 （S3）， 按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、12、24 h在 “2.1”项色谱条件下进样，测得β-榄香烯、呋喃二烯、吉马酮、莪术醇、莪术二酮、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素峰面积RSD值分别为1.43%、0.51%、1.00%、0.90%、0.94%、0.47%、0.90%、0.39%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.5 加样回收率试验 精密称定9份已知质量浓度的供试品 （S3）粉末各0.25 g，每3份分别精密加入供试品中各成分含有量50%、100%、150%对照品溶液，按 “2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在 “2.1”项色谱条件下进样，计算加样回收率。结果表明，β-榄香烯、呋喃二烯、吉马酮、莪术醇、莪术二酮、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素的加样回收率分别为99.75%、98.96%、 99.36%、 98.32%、 97.82%、 99.23%、96.87%、97.67%，RSD分别为 1.23%、1.51%、0.90%、0.85%、0.47%、0.98%、1.90%、1.24%。2.4 样品含有量测定 30批莪术饮片按 “2.2.2”项下方法制备供试品溶液，每个样品平行3份，在“2.1”项色谱条件下进样，计算平均含有量，结果见表3。

2.5 多元数据分析 使用simca-p14.1软件对30批样品进行HCA分析。以莪术饮片8种化学成分的含有量为变量，采用组间Ward联结法，将欧式距离平方和作为样本测度，结果见图2。表明，3个产地的莪术饮片明显聚为3类，四川与广西产地的莪术更为接近，总体来说，温莪术各成分含有量相对其他2个主产地较高。

图2 30批样品聚类树状图Fig.2 Dendrogram of thirty batches of samples

为了进一步探讨3个产地莪术饮片之间的差异，使用非监督模式识别方法PCA对含有量测定数据进行分析，见图3。根据得分矩阵图，第一主成分的贡献率为59.5%，第二主成分的贡献率为31.8%，累计贡献率高达91.3%，表明模型拟合能力良好，能较全面的体现样品之间的差异。30批莪术饮片被分为3类，PCA分析与HCA分析结果相似。

图3 30批样品主成分分析图Fig.3 PCA plot for thirty batches of samples

最后，采用监督模式识别方法O2PLS-DA对不同产地莪术饮片进行分析，见图4。该O2PLS-DA模型， R2Xcum＝0.992， R2Ycum＝0.935， Q2cum＝0.92。其中，R2Xcum反映X矩阵结实率，R2Ycum概括模型的稳定性，Q2cum体现模型的预测性；R2Ycum和Q2cum的值越接近1，模型的稳定性和预测性越好。结果表明，该模型稳定可靠，30批样品聚类较好，分离显著，与PCA分析、HCA分析结果相互验证。结合变量重要性投影值 （VIP），筛选出对莪术分类贡献较大的主要成分，见图5。一般认为，VIP＞1的变量对分类起着关键作用，而且值越大对分类的贡献越大。由图可知，VIP＞1.0的有5个变量，按VIP值大小依次为姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素、莪术二酮、呋喃二烯。

图4 30批样品O2PLS-DA得分图Fig.4 O2PLS-DA score plot of thirty batches of samples

图5 30批样品O2PLS-DA模型中8个主成分的VIP值Fig.5 VIP values of eight chromatographic peaks in O2PLS-DA model of thirty batches of samples

3 讨论

在供试品溶液制备方面，考察了不同的提取方式，结果表明，超声和索氏回流提取效率相近，但前者更节约时间，因此选择超声提取。结合参考文献，分别考察了不同溶剂 （30%、50%、70%、90%乙醇）、提取时间 （15、30、45、60 min）、液料比 （20、40、60、80），确定最佳供试品溶液制备方法为40倍量70%乙醇超声提取30 min。同时对色谱条件进行考察，包括色谱柱 （Hanbon ODS-2 C18色谱柱、Agilent pro shell C18色谱柱）、流动相系统 （乙腈-水、乙腈-甲酸水、乙腈甲酸-甲酸水）、梯度洗脱、体积流量、柱温、波长等，综合考虑基线噪声、对称因子、分离度、洗脱时间等因素，确定最佳色谱条件。

本实验采用HPLC测定了30样品中8种成分的含有量，该方法操作简便、准确度高、重现性好。结合模式识别方法对莪术饮片含有量进行深入分析，结果表明不同产地的莪术饮片可明显分为3类，表明不同产地的莪术饮片质量差异较大，其中姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素、莪术二酮、呋喃二烯等几个成分对分类的贡献较大，莪术醇、吉马酮、β-榄香烯等几个成分差异小。目前，2015版 《中国药典》规定莪术有3个基原，但不同产地莪术饮片有效成分的种类和含有量均存在较大差异，以期2020版 《中国药典》分列制订不同产地莪术饮片含有量的标准。本实验收集的莪术饮片产地有限，后续研究希望增加非道地产区的样本量，为不同产地、不同基原莪术饮片的区分及质量评价提供更加全面的理论依据。