曲妥珠单抗联合吉西他滨对卵巢癌小鼠移植瘤生长及免疫功能的影响

张 皓 周跃华 尧良清

(复旦大学附属妇产科医院妇科，上海 200011)

卵巢癌是女性生殖器官常见的肿瘤之一，其致死率占各类妇科肿瘤的首位，对女性生命造成严重威胁[1-3]。化疗是重要的辅助治疗手段，在卵巢癌的临床治疗中有重要作用。常用的化疗药物包括：吉西他滨、曲妥珠单抗、卡培他滨等。吉西他滨为抗肿瘤药物，进入人体内后由脱氧胞嘧啶激酶活化，可破坏癌细胞复制过程，改善患者生活质量，对卵巢癌、非霍奇金淋巴瘤等均具有一定疗效[4-6]。曲妥珠单抗是抗Her2的单克隆抗体，可通过附着于Her2，阻止人体表皮生长因子在Her2上附着，达到阻断癌细胞生长的作用，同时还可激发机体自身免疫细胞抵制癌细胞[7-8]。环氧合酶2(Cox-2)能催化合成前列腺素并参与炎症反应，研究认为，在卵巢癌中，Cox-2高表达，下调Cox-2表达可以抑制卵巢癌细胞增殖[9]。本研究通过制备人卵巢癌SKOV3裸鼠移植瘤模型，观察曲妥珠单抗联合吉西他滨对SKOV3裸鼠移植瘤生长的抑制情况及可能的机制，并对小鼠免疫功能因子水平的影响进行分析。以期为临床治疗卵巢癌提供联合用药的实验依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物及细胞 BALB/c裸小鼠42只，雌性，4～5周龄，体质量18～20 g，购自上海加科生物科技有限公司。饲养1周后，随机选取40只小鼠分为4组：对照组、模型组、吉西他滨组和联合组，每组10只。人卵巢癌SKOV3细胞株购自上海匹拓生物科技有限公司。

1.1.2实验试剂 曲妥珠单抗(上海罗氏制药有限公司)、吉西他滨(北京协和药厂)、ELISA试剂盒(上海恒远生物科技有限公司)、胎牛血清(上海劲马实验设备有限公司)、RPMI1640培养基(上海浩然生物技术有限公司)、总蛋白提取试剂盒(上海睿安生物科技有限公司)、蛋白质印迹试剂盒(上海容创生物技术有限公司)、苏木素伊红(HE)染色试剂盒(碧云天生物技术有限公司)、Cox-2兔抗鼠多克隆抗体(艾博抗贸易有限公司)。

1.2方法

1.2.1移植瘤动物模型的制备[10]待传代培养的SKOV3细胞增殖至铺满培养瓶底部后，取对数生长期细胞，PBS清洗后，调至活细胞浓度为4×107个/ml的细胞悬液，各吸取0.1 ml，分别于无菌环境下接种于2只裸鼠右侧腋窝皮下，10 d后形成移植瘤，处死裸鼠，取处于生长旺盛期的瘤组织剪成约1.0 mm3左右，无菌条件下接种于模型组、吉西他滨组及联合组裸鼠右侧腋窝皮下。对照组正常饲养，不给予任何处理。

1.2.2给药方案 待各组小鼠体内移植瘤长至约150 mm3时(约20 d)，分别取各组裸鼠称重。治疗给药方案如下：①对照组：0.9%生理盐水0.1 ml；②模型组：0.9%生理盐水0.1 ml；③吉西他滨组：吉西他滨(50 mg/kg)0.1 ml；④联合组：吉西他滨(50 mg/kg)0.1 ml+曲妥珠单抗(30 mg/kg)0.1 ml。各组均经尾静脉给药，1次/周，连续治疗6周。

1.2.3移植瘤观察 隔日观察各组裸鼠移植瘤生长情况及与治疗药物相关的不良反应。测量移植瘤长径(a)及短径(b)，称取裸鼠体质量，1次/周。移植瘤体积(Tumor volume，TV)=1/2(ab2)。抑瘤率(%)=[(模型组瘤体积-实验组瘤体积)/模型组瘤体积]×100%。

1.2.4病理学观察 治疗结束后1周，处死裸鼠，完整剥离瘤体，检查肝、肾有无肿瘤转移及有无腹水。取瘤组织进行HE染色，利用光学显微镜进行组织学观察。

1.2.5Cox-2水平检测 利用蛋白质印迹法检测各组裸鼠瘤组织中Cox-2蛋白的表达。按照试剂盒说明书操作提取各组裸鼠瘤组织中总蛋白，于聚丙烯酰胺凝胶电泳(5%积层胶，8%分离胶)分离蛋白；上样，电泳；采用湿式转膜方式检测Cox-2的蛋白表达。

1.2.6免疫功能指标分析 各组裸鼠处死后，同时摘除眼球取血，室温下静置45 min，3 000 r/min离心15 min，吸取上层血清待检测，利用ELISA 试剂盒检测各组裸鼠血清中IFN-γ和IL-4水平，并计算IFN-γ/IL-4比值。实验操作严格按照试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1移植瘤生长情况 SKOV3细胞移植10 d时，在两只裸鼠右侧腋窝皮下均可见直径约3 mm大小的类圆形硬块，高出皮肤表面，不可移动，成瘤率为100%。将瘤块接种于裸鼠后，模型组移植瘤生长良好，3周后体积逐渐增大，质硬，可活动，与胸壁不黏连。治疗前各组裸鼠体质量及移植瘤体积比较差异无统计学意义(P>0.05)。用药治疗后，吉西他滨组和联合组移植瘤体积较模型组小，体质量较模型组低，且联合组移植瘤体积与裸鼠体质量明显低于吉西他滨组，抑瘤率明显高于吉西他滨组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。未观察到与治疗药物相关的腹泻、食欲下降、脱毛等不良作用，处死裸鼠后，检查心、肝、肺、肾、胃肠道均未见明显肿瘤转移灶及腹水。

2.2HE染色 HE染色结果显示：①模型组：肿瘤细胞较多，排列紧密，细胞异型性明显，核大深染，细胞核质比例明显增大，可见核分裂相，少量凋亡细胞；②吉西他滨组和联合组：肿瘤细胞数目减少，排列稀疏，细胞核染色较浅，细胞核质比例减小，核分裂相减少，细胞胞浆多为透明空泡状，凋亡细胞核固缩，可见凋亡小体。各组裸鼠的肝、肾均未见特殊病理改变。见图1。

2.3Cox-2蛋白表达水平 Western blot检测结果显示：与模型组比较，吉西他滨组和联合组Cox-2蛋白表达有不同程度的减少，且联合组Cox-2蛋白表达的抑制程度更明显(P<0.05)。见表2、图2。

表1 各组裸鼠移植瘤生长情况比较Tab.1 Comparison of growth of transplanted tumor in nude mice

图1 各组小鼠形态学比较(HE，×400)Fig.1 Comparison of morphology of nude mice in each group(HE，×400)

图2 Western blot检测各组裸鼠Cox-2蛋白表达情况Fig.2 Expression of Cox-2 protein in nude mice detected by Western blot

表2 Cox-2蛋白表达情况比较Tab.2 Comparison of Cox-2 protein expression

表3 各组裸鼠免疫功能指标水平比较Tab.3 Comparison of immunological index levels in nude mice

2.4免疫功能指标分析 与对照组比较，模型组、吉西他滨组和联合组裸鼠血清中IFN-γ、IL-4及IFN-γ/IL-4水平均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，吉西他滨组和联合组裸鼠血清中IFN-γ、IL-4及IFN-γ/IL-4水平均明显升高，且联合组升高趋势更明显，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

3 讨论

长期以来，卵巢癌都被视作女性健康的隐性杀手。卵巢癌进展过程中，不同的免疫细胞及细胞因子相互作用，可导致免疫反应的动态变化[10]。目前，临床治疗卵巢癌一般根据肿瘤病理类型不同而选择相应的治疗方案，包括手术治疗、化疗、结合中医中药等综合治疗。吉西他滨为抗癌常用药物，能改善患者的生活质量，对多种实体肿瘤具有较好的治疗效果[11-14]。曲妥珠单抗是一种重组DNA衍生的人源化单克隆抗体，具有较强的抗肿瘤活性[15]。本实验结果发现：本次SKOV3细胞移植成瘤率为100%。将瘤块接种于裸鼠后，模型组瘤块体积逐渐增大，质硬，可活动，与胸壁不黏连。用药治疗后，与模型组比较，吉西他滨组和联合组移植瘤体积减小，体质量降低，且联合组移植瘤体积与裸鼠体质量明显低于吉西他滨组，抑瘤率明显高于吉西他滨组，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，吉西他滨组和联合组肿瘤细胞数目减少，可见凋亡小体。表明，吉西他滨和曲妥珠单抗对移植瘤生长均有抑制作用，且联合用药对移植瘤的抑制作用更明显。

环氧化酶即前列腺素内氧化酶还原酶，具有环氧化酶和过氧化氢酶活性。Cox-2为其诱导型同工酶，可通过诱导花生四稀酸氧化，及其他加速肿瘤细胞形成的活化产物的产生，促进肿瘤细胞的增殖，其在卵巢恶性肿瘤中的表达高于正常的卵巢组织中[16]。本次实验结果显示：吉西他滨组和联合组裸鼠Cox-2蛋白表达水平均明显低于模型组，且联合组变化趋势更明显，差异有统计学意义(P<0.05)。表明吉西他滨和曲妥珠单抗均可下调卵巢癌裸鼠Cox-2蛋白表达，且联合用药对Cox-2蛋白抑制作用更明显。已有研究表明，曲妥珠单抗可通过下调肿瘤组织中Cox-2表达，促进肿瘤细胞凋亡[17]。因此推断，联合用药对肿瘤生长的抑制作用与抑制Cox-2蛋白表达有关。

IFN-γ是水溶性二聚体细胞因子，由活化T细胞和自然杀伤细胞(NK cell)产生，具有免疫调节及抗肿瘤特性。研究表明，吉西他滨可以抑制ID8卵巢癌细胞移植瘤的生长。通过上调血清中IFN-γ和IL-2水平，改善荷瘤小鼠免疫功能[10]。目前关于卵巢癌荷癌小鼠体内Th1/Th2细胞平衡的研究报道较少。王丽华等[18]报道，卵巢癌患者存在免疫功能紊乱，表现为Th1/Th2失衡。本研究选取IL-4为观察指标。IL-4属于Th2细胞产生的特征性细胞因子，具有增强特异和非特异性杀伤的作用。本次实验结果显示：模型组、吉西他滨组和联合组裸鼠血清中IFN-γ、IL-4及IFN-γ/IL-4水平均明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。吉西他滨组和联合组裸鼠血清中IFN-γ、IL-4及IFN-γ/IL-4水平均明显高于模型组，且联合组水平升高趋势更加明显，差异有统计学意义(P<0.05)。表明吉西他滨和曲妥珠单抗均可上调裸鼠血清中免疫功能指标因子及Th1/Th2细胞平衡水平，且联合用药对上述指标的调控作用更明显。研究发现，曲妥珠单抗可以增加NK细胞对IFN-γ、TNF-α的分泌作用。其作用机制可能与影响细胞周期，抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖有关。

综上所述，曲妥珠单抗联合吉西他滨可有效抑制裸鼠移植瘤生长，其机制可能与下调Cox-2蛋白表达有关，此外联合用药还能改善裸鼠免疫功能，对卵巢癌裸鼠具有一定治疗效果。