miRNA-145对结肠癌细胞体外增殖、侵袭、凋亡的影响

祝 磊 李炳强 陈 晨

(新疆石河子大学医学院第一附属医院，石河子 832000)

结肠癌发病率和死亡率分别占全身恶性肿瘤的第3位和第4位，全球每年有120万新发病例，超过60万死亡病例，严重威胁患者的生命安全和生活质量[1]。结肠癌的临床治疗方案主要为手术切除为主联合放疗、化疗的综合疗法，因结肠癌早期缺乏特异性表现，多数患者诊断时已处于中晚期，化疗是主要治疗方式，5年生存率不足40%，复发和转移是影响疗效的主要因素[2]。寻找新的治疗方法和策略，改善结肠癌治疗效果成为临床研究的热点，基因治疗是癌症治疗的新理念，明确影响结肠癌发病和进展的生物学、基因学特点可为基因学治疗和预后改善提供新证据[3]。miRNA-145是位于人染色体5q32-33的小分子RNA，卵巢癌、前列腺癌、食管癌等癌旁组织均可见miRNA-145表达，它具有阻止细胞癌变和抑制癌细胞生长等作用，miRNA-145表达的变化对肿瘤的发生、增殖、侵袭、凋亡等均有一定影响，但在结肠癌中的研究较少[4-5]。本研究将人工化学合成的miRNA-145拟似物和阻遏物转染结肠癌HCT116细胞，探讨miRNA-145对结肠癌HCT116细胞增殖、侵袭、凋亡的影响，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株 结肠癌细胞株HCT116购自中国科学院细胞库。

1.1.2主要试剂及仪器 胎牛血清、0.25%胰蛋白酶购自武汉普诺赛生命科技有限公司；Lipofectamine 2000转染试剂、Trizol和反转录试剂盒购自武汉科昊佳生物科技有限公司；RT-PCR试剂盒购自日本Takara公司；MTT、Transwell小室购自北京优尼康生物科技有限公司。

细胞培养箱购自长沙华曦电子科技有限公司；分光光度计、酶标仪、PCR仪购自美国HACH公司；化学法合成miRNA-145拟似物、阻遏物和阴性对照物、miRNA拟似物、阻遏物、阴性对照物合成、测序均由大连宝公司进行。

1.2方法

1.2.1细胞培养 细胞株复苏后，用含10%胎牛血清的RMPI1640培养液将细胞以1×106ml-1的密度培养于37℃、5%CO2细胞培养箱中，隔天更换培养液。

1.2.2细胞转染 取对数生长期的HCT116细胞，胰酶消化后1 000×g离心2min，收集细胞，调整细胞密度至1×105ml-1，接种至6孔细胞培养板，每孔添加2 ml细胞悬液，37℃和5%CO2条件下培养24 h，共分为4组，即空白对照组(Blank control group，BC组)只转染试剂，阴性对照组(Negative control group，NC组)转染miRNA145阴性对照物，miRNA145拟似物转染组(Mimetic transfection group，MT组)转染miRNA145拟似物，miRNA145阻遏物转染组(Repressor transfection group，RT组)转染miRNA145阻遏物，转染过程按照Lipofectamine 2000说明进行。

1.2.3HCT116增殖活性检测 转染后48 h，胰酶消化法制备HCT116细胞悬液转移至96孔板中，调整细胞密度1×105ml-1，每孔含1×104个，每组设6个复孔，接种后24 h、48 h、72 h每孔加入20 μl MTT，继续培养4 h后，弃上清液，加入100 μl DMSO溶解沉淀，震动混匀沉淀15 min，酶标仪比色，记录490 nm处吸光度值。

1.2.4转染后细胞内miRNA-145表达检测 与MTT检测同时间点取细胞样本，采用6孔板接种密度2×105个/孔，酚氟仿法抽取RNA，取2 μg总RNA，反转录制备cDNA，取2 μl反转录产物作为PCR反应模板，荧光定量法检测miRNA-145含量，反应条件：95℃变性10 s，58℃退火10 s ，72℃延伸10 s，循环数设置为40。引物序列：miRNA-145：上游：5′-GCCGGCGCCCGAGCTCTGGCTC-3′，下游：5′-GTCCAGTTTTCCCAGGAATCCCT-3′；内参(RTU6)：上游：5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACAT-3′，下游：5′-TACCTTGCGAAGTGCTTAAAC-3′。2-ΔΔCt法分析定量结果。

1.2.5Transwell小室法检测HCT116细胞侵袭 取转染后HCT116细胞1×105ml-1，接种于Transwell板上室，每孔160 μl，加入20%ASPS血清40 μl，800 μl RMPI1640培养基加入下室，培养24 h，计数基底膜下室细胞数，采用在400×显微镜下随机选取中央和上下左右5个视野的穿越基底膜细胞数，取均值。

1.2.6Annexin V-FITC/PI双染法检测转染后HCT116细胞凋亡情况 转染72 h后HCT116细胞以0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)消化收集，用PBS洗涤细胞2次，加入500 μl Binding Buffer悬浮，再加入5 μl Annexin V-FITC混匀，最后加入5 μl PI混匀，室温避光反应10 min后，采用流式细胞仪检测各组的细胞凋亡情况。

2 结果

2.1HCT116增殖活性比较 细胞活性检测结果显示，转染后24 h、48 h、72 h时拟似物转染组细胞增殖活性显著低于空白对照组、阴性对照组和阻遏物转染组(P<0.05)，空白对照组和阴性对照组细胞增殖活性差异无统计学意义(P>0.05)，阻遏物转染组细胞增殖活性显著高于空白对照组、阴性对照组和拟似物转染组(P<0.05)。见图1。

2.2HCT116细胞内miRNA-145表达 RT-PCR结果显示，转染24 h、48 h、72 h时拟似物转染组miRNA-145表达显著高于空白对照组、阴性对照组和阻遏物转染组，阻遏物转染组miRNA-145表达显著低于拟似物转染组、空白对照组和阴性对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；空白对照组和阴性对照组miRNA-145表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图1 HCT116增殖活性比较Fig.1 Comparison of HCT116 proliferation activity

图2 HCT116细胞内miRNA-145表达Fig.2 Expression of miRNA-145 in HCT116 cells

2.3HCT116细胞侵袭能力比较 Transwell小室法检测结果显示，拟似物转染组穿膜细胞数显著少于空白对照组、阴性对照组和阻遏物转染组，阻遏物转染组穿膜细胞数显著多于空白对照组、阴性对照组和拟似物转染组，差异均有统计学意义(P<0.05)；空白对照组和阴性对照组穿膜细胞数相比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见图3。

2.4HCT116细胞凋亡水平相比较 Annexin V-FITC/PI双染法检测结果显示，拟似物转染组细胞凋亡率显著高于空白对照组、阴性对照组和阻遏物转染组，阻遏物转染组细胞凋亡率显著低于空白对照组、阴性对照组和拟似物转染组，差异均有统计学意义(P<0.05)；空白对照组和阴性对照组细胞凋亡率相比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

图3 HCT116细胞侵袭能力比较Fig.3 Comparison of the invasiveness of HCT116 cells

图4 HCT116细胞凋亡水平相比较Fig.4 Comparison of HCT116 cell apoptosis level

3 讨论

结肠癌的发生和发展是多步骤、多因素的进行性过程，详细机制尚未完全阐明，探讨其发病机制有助于对其有更深入的了解，并有助于指导临床治疗。miRNA为高保守、高组织特异性且无蛋白编码的小分子RNA，是转录后水平调控基因表达的关键因子，调节着人类三分之一的基因，参与诸多生理病理过程，在肿瘤的发生发展中发挥重要作用[6]。miRNA-145长度约4.08 kb，可通过调控IRS-1、IGF-IR、C-myc、RTKN、ERBB、BNIP3、YES、STAT1、EGFR、MUC-1等靶基因影响肿瘤细胞的生长、分化、侵袭、凋亡等过程[7]。

近年来的研究显示，miRNA-145在前列腺癌、胃癌、喉癌、肾癌、宫颈癌、非小细胞肺癌等肿瘤中均表现为水平下调，提示正常机体中miRNA-145可能抑制原癌基因激活，miRNA-145功能受到抑制可能是原癌基因激活的重要原因[8-13]。王丹等[14]研究显示，miR-145与Sp1在肺腺癌A549细胞中表达呈显著相关性，miR-145异常表达可能是Sp1基因表达的关键原因，miR-145可能通过对Sp1表达的调控影响A549细胞生物学行为。赵一奇等[15]研究认为，miR-145可下调肿瘤转移基因Mucl，沉默Mucl表达，调控肿瘤生长和抑制肿瘤转移，可能是临床肿瘤治疗的潜在手段。

本研究通过脂质体转染法转染miRNA-145拟似物和阻遏物至HCT116细胞，RT-PCR检测显示拟似物转染组HCT116细胞miRNA-145表达较空白对照组和阴性对照组显著升高，而阻遏物转染组HCT116细胞miRNA-145表达较空白对照组和阴性对照组显著降低。抑制miRNA-145表达则增强HCT116细胞增殖、侵袭活性、降低肿瘤细胞凋亡，增强miRNA-145表达则可降低HCT116细胞增殖、侵袭活性和增加肿瘤细胞凋亡。这些实验结果和数据提示，miRNA-145表达异常是影响HCT116细胞增殖、侵袭、凋亡重要因素，这为新的基因靶点的药物开发提供了思路。