混菌发酵联合分段控温工艺提高柑橘皮渣可溶性膳食纤维含量

曹 艳，范 铭，童 创，陆胜民，*，杨 颖，邢建荣，郑美瑜，唐伟敏，刘 哲

(1.浙江省农业科学院 食品科学研究所，农业农村部果品采后处理重点实验室，浙江省果蔬保鲜与加工技术研究重点实验室，浙江 杭州 310021； 2.浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华 321004)

柑橘是世界上产量最大的水果之一。我国是世界第一大柑橘生产国，2016年，我国柑橘产量约3 500万t。皮和渣等副产物约占柑橘鲜重的30%～50%[1]，其中含有大量糖类、有机酸、维生素等营养物质，以及黄酮、精油等有益成分[2]。目前，国内只有小部分柑橘果皮用于提取果胶和香精油，以及入药或加工成饲料，大部分皮渣被作为废弃物直接丢弃，造成了极大的资源浪费。

膳食纤维是一类来源于植物的非淀粉多糖，分为可溶性膳食纤维(soluble dietary fiber， SDF)和不可溶性膳食纤维(insoluble dietary fiber， IDF)2类，具有调节肠道菌群、预防肠道疾病、辅助调节血糖血脂水平、预防心血管疾病等多种功效。SDF可溶于水，也可吸水膨胀，并能被肠道微生物酵解，主要包括果胶、植物胶、黏胶等。IDF不溶于水，也不能被肠道微生物酵解，主要包括纤维素、半纤维素、木质素等[3-5]。Schneeman等[6]提出，当膳食纤维中SDF的含量在30%～50%时，可达到平衡膳食的要求。目前市场上的膳食纤维主要来自谷物及豆渣、薯渣、甜菜渣等农产品加工副产物，但其中SDF所占比例都很小(占副产物原料干重的4%～10%)[7-10]，不仅生理活性较低，而且口感粗糙，达不到平衡膳食的要求。Baker[11]和Grigelmo-Miguel等[12]研究表明，柑橘皮渣可以作为优质膳食纤维的制备原料，其SDF含量高于谷物来源的膳食纤维。因此，利用柑橘皮渣生产膳食纤维具有丰富的材料来源和良好的市场前景。

常规制备膳食纤维的方法有化学法、物理法、生物法等。化学法、物理法制备过程中会产生大量废水，对产品产量及产物性能无明显的改善作用；而利用微生物发酵法制备膳食纤维，条件温和且绿色环保[13-16]。目前，已有以柑橘皮渣或其他水果皮渣为原料通过固态发酵法制备SDF的研究[1，17-18]，但基本采用单一种类的发酵菌株和恒定发酵条件，总膳食纤维(total dietary fiber， TDF)和SDF比例提高有限。

本文在前期研究基础上进一步优化发酵工艺，采用混菌发酵联合分段控温工艺，提高脐橙皮渣发酵产物中TDF和SDF含量，制备高品质柑橘膳食纤维。同时，研究了该工艺对浙江主栽柑橘品种皮渣发酵生产膳食纤维的适用性，旨在扩大柑橘皮渣原料范围，提高资源利用率，减少环境污染。

1 材料与方法

1.1 主要原料

取赣南脐橙、温州蜜柑和常山胡柚剥皮分瓣后榨汁，将残留的皮和渣分别烘干至手抓成团、落地即散的程度(含水量约70%)，冷冻保存。其中：赣南脐橙为本研究的主要原料，用于确定提高SDF含量的最佳发酵工艺；温州蜜柑和常山胡柚作为代表性柑橘皮渣原料，用于对最佳发酵工艺的适用性进行验证。

1.2 菌种

青霉菌Penicilliumsp. CIs14，实验室自行筛选的可产高活性纤维素酶的菌株，适用于柑橘皮渣发酵生产膳食纤维，经口急性毒性实验证明无毒[19]。菌种保存于-80 ℃冰箱，培养基上活化长出孢子后用于发酵种子培养。

植物乳杆菌Lactobacillusplantarum，实验室自行筛选。菌种保存于-80 ℃冰箱，发酵之前经培养基活化。

1.3 培养基组成及培养条件

植物乳杆菌种子培养液：蛋白胨1.0%(质量分数，下同)，牛肉膏1.0%，酵母提取液0.5%，葡萄糖2.0%，乙酸钠 0.5%，柠檬酸氢二胺0.2%，吐温-80 0.1%，K2HPO40.2%，MgSO4·7H2O 0.02%，MnSO4·7H2O 0.005%，110 ℃灭菌20 min。将活化后的植物乳杆菌接种于培养基中，28 ℃静置培养2～3 d。

青霉菌柑橘皮渣种子培养基：柑橘皮和渣按2∶1(质量比)混合均匀，添加蛋白胨0.2%(质量分数，下同)、酵母粉0.1%、MgSO4·7H2O 0.1%，110 ℃灭菌20 min。将活化后的青霉菌孢子制成孢子悬浮液，接入培养基中，接种量10%(质量分数)，在28 ℃、相对湿度60%～80%条件下培养3～4 d[19]。

柑橘皮渣发酵培养基：柑橘皮和渣按2∶1(质量比)混合均匀，添加蔗糖2%(质量分数，下同)、蛋白胨0.2%、酵母粉0.1%、KH2PO40.37%、K2HPO40.11%、(NH4)2SO40.3%、MgSO4·7H2O 0.22%，搅拌均匀，分装于500 mL烧杯中，厚度3～5 cm，110 ℃灭菌20 min。

单一菌种发酵工艺(工艺1)：柑橘皮渣发酵培养基接种10%(质量分数)植物乳杆菌或青霉菌，在28 ℃、相对湿度60%～80%条件下培养2或5 d。

青霉菌发酵联合分段控温工艺(工艺2)：柑橘皮渣发酵培养基中接种10%(质量分数)青霉菌，在28 ℃、相对湿度60%～80%条件下培养5 d，向发酵结束的皮渣中添加100～200 mL无菌水，搅拌均匀，在45 ℃条件下100 r·min-1振荡培养24 h。

混菌发酵工艺(工艺3)：柑橘皮渣发酵培养基中先接种10%(质量分数，下同)植物乳杆菌，28 ℃培养2 d后，接种10%青霉菌种子培养基，在28℃、相对湿度60%～80%条件下培养5 d。

混菌发酵联合分段控温工艺(工艺4)：柑橘皮渣发酵培养基中先接种10%(质量分数，下同)植物乳杆菌，28 ℃培养2 d后，接种10%青霉菌，继续于28 ℃、相对湿度60%～80%条件下培养5 d。向发酵结束的皮渣中添加1.5倍体积无菌水，搅拌均匀，在45 ℃条件下100 r·min-1放置24 h。

1.4 发酵样品后处理

将不同种类柑橘皮渣或发酵产物于80 ℃烘至恒重，粉碎，过50目筛。过筛后的粉末样品用于测定TDF、SDF和IDF含量。

1.5 膳食纤维提取及含量测定

称取烘干粉碎过筛后的样品10 g置于烧杯中，各加入250 mL pH 6.8的PBS缓冲液，超声30 min至样品完全分散。加入1 mL木瓜蛋白酶溶液(25 kU·mL-1)，用铝箔盖住，60 ℃超声30 min，过滤。滤渣用蒸馏水洗涤3次，每次100 mL，收集合并洗涤液，转移至烧杯中，加入4倍体积的95%(体积分数，下同)乙醇(预热至60 ℃)，用铝箔盖住烧杯，室温沉淀1 h，过滤，残渣分别用150 mL 78%乙醇、95%乙醇和丙酮各冲洗2次，50 ℃烘干并称量，得到SDF含量。残渣分别用150 mL 78%乙醇、95%乙醇和丙酮各冲洗2次，50 ℃烘干、称量，得到IDF含量[20]，计算得到TDF含量及SDF/TDF。

1.6 数据统计分析

所有数据均采用Excel 2010进行整理，并在SPSS 19.0软件上进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 单一菌种发酵柑橘皮渣产物中TDF和SDF的含量

从表1可以看出，单独接种植物乳杆菌发酵后的脐橙皮渣中SDF和TDF含量分别为25.8%和81.7%，SDF/TDF为31.5%，比未发酵的脐橙皮渣分别提高150.5%、35.0%和85.3%。单独接种青霉菌发酵后的脐橙皮渣中SDF和TDF含量分别为31.4%和88.6%，SDF/TDF为35.5%，比未发酵的脐橙皮渣分别提高204.9%、46.4%和108.8%。

表1不同发酵条件下脐橙皮渣中SDF、IDF和TDF的含量

Table1Contents of SDF， IDF and TDF in navel orange peel and pomace under different treatments

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同列数据后无相同字母的表示差异显著(P<0.05)。下同。

Data marked without the same letters in the same column indicated significant difference atP<0.05. The same as below.

2.2 不同发酵工艺下脐橙皮渣中TDF和SDF的含量

如表2所示，相较于青霉菌发酵(工艺1)，青霉菌发酵联合分段控温工艺(工艺2)和混菌发酵工艺(工艺3)下，SDF含量和SDF/TDF显著(P<0.05)提高，但工艺2和工艺3下各指标并无显著差异。在混菌发酵联合分段控温工艺下，发酵产物中SDF含量和SDF/TDF比单独接种青霉菌发酵下分别提高33.8%和30.1%，且较工艺2和工艺3条件下也有显著(P<0.05)提高。

2.3 混菌发酵联合分段控温工艺的适用性

从表3可以看出，采用混菌发酵联合分段控温工艺的蜜柑和胡柚皮渣中SDF、TDF含量和SDF/TDF均比未发酵皮渣显著(P<0.05)提高， SDF含量和SDF/TDF分别比单独接种青霉菌发酵条件下提高25.6%和22.3%以上。

表2不同发酵工艺下发酵产物中膳食纤维各组分含量

Table2Contents of SDF， IDF and TDF under different fermentation technologies

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表中工艺1仅采用青霉菌单独发酵。

In the above table， technology 1 only appliedPenicilliumsp. Cis14 during the fermentation.

表3蜜柑和胡柚皮渣经发酵后膳食纤维中SDF、IDF、TDF含量及SDF/TDF

Table3Contents of SDF， IDF and TDF and SDF/TDF in peel and pomace fromCitrusunshiuMarc. and Changshan Hu-You before and after fermentation

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3 讨论

本研究通过比较不同发酵工艺条件下赣南脐橙皮渣发酵产物中的SDF、TDF含量和SDF/TDF，提出能够显著提高脐橙皮渣中SDF、TDF含量和SDF/TDF的混菌发酵联合分段控温工艺。利用该工艺发酵脐橙皮渣后，SDF、TDF含量和SDF/TDF高于单独以青霉菌发酵条件下的对应指标。该工艺同样适用于以温州蜜柑和常山胡柚皮渣为原料生产高品质膳食纤维。

植物乳杆菌是以纤维类原料制备膳食纤维的常用菌株之一，发酵过程中产生以乳酸为主的大量有机酸，使纤维素的糖苷键断裂，打断纤维素大分子的长链结构，破坏纤维素原料致密结构，从而提高可溶性膳食纤维的含量，但其作用部位一般在物料表面[16-17，21]。青霉菌分泌的纤维素酶(内切纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶)具有较强的纤维素分解能力，可以结合到纤维素大分子上将其水解成可溶于水的分子量较小的糖类，同时降低纤维素的聚合度[17，22]。酶水解纤维素是目前兼具环保绿色、转化效率高等优点的处理方式[23]。因此，利用青霉菌发酵提高柑橘皮渣中可溶性膳食纤维含量的效果优于植物乳杆菌，这与本研究结果一致。目前报道的可用于发酵法制备膳食纤维的菌种主要为绿色木霉，但前期研究表明，本研究所用青霉菌对柑橘皮渣的发酵性能亦优于绿色木霉[19]。

利用发酵法制备膳食纤维过程中，植物乳杆菌和青霉菌的作用原理不同[16，24]。已有研究表明，先通过物理作用使纤维素结构膨大，然后添加适量纤维素酶，可大幅提高纤维素的水解率[25]。常用纤维素酶的最适温度范围为45～75 ℃，但发酵过程中的温度仅适合菌体大量生长和酶的合成，并不是纤维素酶水解底物的最适温度[22，24]。因此，单独接种青霉菌的发酵条件下，虽然菌体大量生长并分泌了足够的纤维素酶，但纤维素酶的活力并没有达到最大，导致脐橙皮渣中纤维素水解率较低，使得SDF和TDF含量的提高幅度较小。因此，有必要将不同发酵条件组合进行分步发酵，充分发挥不同条件的优势作用，进一步提高SDF、TDF含量及SDF/TDF[1]。本试验结果显示，在混菌发酵联合分段控温条件下，发酵产物中SDF含量和SDF/TDF比单独接种青霉菌发酵条件下显著提高33.8%和30.1%。据此，我们推测：首先接种植物乳杆菌发酵后，所产乳酸会破坏脐橙皮渣中表面的纤维结构，使得脐橙表面纤维结构膨大、疏松，暴露出更多的纤维素酶作用位点[21]，这使得第二步接种青霉菌发酵所产的纤维素酶与皮渣中纤维素的可及度和有效接触面积增加，从而提高了脐橙皮渣中纤维素的水解率，最终使得发酵后的脐橙皮渣中SDF含量和SDF/TDF大幅提高。

浙江省是我国柑橘主产区之一，不仅种植面积大，而且品种繁多。混合菌种发酵联合分段控温工艺是以脐橙皮渣为原料提出的，因此，本研究特别选择了另外2种具有代表性的柑橘品种——温州蜜柑和常山胡柚验证该工艺的适用性。结果显示，该工艺对于不同品种的柑橘皮渣适用性良好，且该工艺对柑橘皮渣中SDF含量和SDF/TDF提高幅度高于已有的研究报道[18]。

今后，笔者团队将从原料纤维结构变化、发酵产品粒径分析及纤维素组成等方面深入研究该工艺提高SDF、TDF含量和SDF/TDF的作用机理，进一步指导、改进发酵工艺，充分运用柑橘皮渣资源生产高品质膳食纤维。