基于体外降糖活性的桑葚渣水提物的超声辅助工艺优化

范 铭，向 露，刘 哲，陆胜民，*

(1.浙江省农业科学院 食品科学研究所，浙江省果蔬保鲜与加工技术研究重点实验室，农业农村部果品采后处理重点实验室，浙江 杭州 310021； 2.浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华 321004)

桑葚属于桑科，被列入药食同源名录，鲜果味道甜美、多汁，含有人体所必需的营养素如维生素、氨基酸、矿物质以及具有生理活性的花色苷、黄酮、酚酸类化合物。大量研究表明，桑葚提取物在降血糖、增强免疫、降血脂、抗氧化、抗肿瘤等方面有显著的作用[1-2]。目前，大多数关于桑葚的研究主要集中于其化学成分[3]、营养成分[4]、药理作用[5]以及桑葚产品(桑葚酒[6]、桑葚醋[7]、桑葚汁[8])等方面，但对桑葚中主要起降血糖功效的物质提取工艺却鲜见报道。本文主要采用超声辅助水提取法优化提取桑葚渣中对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性有抑制作用的物质成分，据文献报道桑葚水提液中槲皮素、花色苷以及多糖等物质均有降血糖的作用[3]，这也为工业大规模提取桑葚渣中降糖功能因子提供科学依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料

桑葚品种大十，采摘于浙江省安吉县梅溪镇马村桑葚基地。榨汁后的桑葚渣以每袋500 g进行分装，保存于-20 ℃的冰箱中，备用。

1.2 仪器

DHG-9146A电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验室备有限公司)；SCIENTZ-18N冷冻干燥机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；BJ-300多功能粉碎机(拜杰公司)；电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；KQ-500DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；LXJ-ⅡB型离心机(上海安亭科学仪器厂)；RE-52A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；UV-1800紫外分光光度计(日本岛津公司)。

1.3 试剂

可溶性淀粉、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、碳酸钠购于上海国药集团；对硝基苯基-α-D葡萄糖吡喃苷(PNPG)购于上海源叶生物科技有限公司；二甲基亚砜购于上海凌峰化学试剂有限公司；α-淀粉酶(猪胰腺淀粉酶)、α-葡萄糖苷酶均购于Sigma公司。

1.4 方法

1.4.1 桑葚渣中降糖物质提取

称取在-20 ℃中冷冻的桑葚渣(含水量89%)500 g平铺于托盘中，鼓风干燥箱中干燥至恒重。干燥条件为50 ℃、48 h。将干燥后的桑葚渣打粉。称取干燥后的桑葚渣粉5 g，按预设的料液比加入去离子水，充分混匀后，置于预设的提取条件下进行超声提取，超声提取结束后，放入凉水中冷却，4 000 r·min-1离心10 min留取上清液，即得含有降糖因子的桑葚渣提取原液。将提取原液在50 ℃条件下减压浓缩至一定体积，将其冷冻干燥(条件：阱温度-40 ℃左右，真空度0.025 MPa，干燥72 h)后用蒸馏水配成一定的浓度。体外测定其对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶活性的抑制率，以此作为指标研究提取液的降糖效果。

1.4.2 体外降糖指标及其测定方法

α-葡萄糖苷酶活性抑制体系。通过抑制小肠上端α-葡萄糖苷酶的活性，阻碍直链或支链低聚糖单元如α-糊精、麦芽糖、麦芽三糖分解产生葡萄糖的过程，从而阻止葡萄糖吸收到血液中，限制胃肠道对食物中碳水化合物的吸收[9]。对α-葡萄糖苷酶的抑制率大小可以作为体外判断某种物质抑制血糖能力的大小。

取10 mmol·L-1PNPG 100 μL，加入850 μL磷酸缓冲液(pH 6.8)，再加入样品抑制剂， 37 ℃孵化10 min，加入酶50 μL(2 U·mL-1)，再孵化50 min，加入1 mL 1 mol·L-1的Na2CO3终止反应后在405 nm测吸光度(表1)，并计算抑制率[10]。空白对照为不加酶的反应体系，以消除PNPG本身氧化产生对硝基苯酚(PNP)而影响测定结果，以拜糖平为阳性对照[10]。

表1α-葡萄糖苷酶活性抑制体系

Table1Reaction system of α-glucosidase inhibitory activity

处理Treatmentα-葡萄糖苷酶α-glucosidase/μL抑制剂Inhibitor/μLPNPG/μL磷酸缓冲液pH 6.8Phosphate buffer pH 6.8/μL空白管Blank tube(A)50—100850空白对照Blank control(B)——100850抑制剂管Inhibitor tube(C)5025100850背景对照Background control(D)—25100850

α-淀粉酶活性抑制体系。抑制剂能通过抑制肠道内唾液和α-胰淀粉酶的活性，阻碍食物中碳水化合物的消化吸收，可有效控制餐后血糖的升高，间接减少体内脂肪的合成，延缓糖尿病的发生和发展[9]。

取50 μL α-淀粉酶(2 U·mL-1)和一定浓度的抑制剂25 μL，在37 ℃孵化10 min，加入0.75%可溶性淀粉1 mL，37 ℃反应5 min，加入1 mL DNS试剂，沸水浴5 min，迅速水浴冷却后用蒸馏水稀释2.5倍，540 nm处测定吸光值，并计算抑制率[10]。反应体系如表2。

1.4.3 单因素试验

分别以超声功率200、300、350、400、500 W、超声温度30、40、50、60、70 ℃、超声时间0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h、料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g·mL-1)为影响因素，设置4个因素的不同水平，以确定相关因素对提取液中降糖因子含量的影响水平。

1.4.4 正交试验

根据单因素试验结果，设计正交试验，分析正交试验结果，确定桑葚渣中降糖因子的最佳提取工艺条件。

1.5 数据统计分析

所有试验重复3次。试验数据采用Excel 2010、SPSS 17.0进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制率的影响

如图1所示，桑葚渣水提液对α-淀粉酶的抑制率先升高后降低，料液比为1∶40(g·mL-1)时，对α-淀粉酶的抑制率最高为66.7%，而料液比为1∶30(g·mL-1)时，对α-葡萄糖苷酶的抑制率最高为69.1%，这可能是由于溶剂用量的增加可以增加固液接触面积，提高扩散速度，但随着溶剂用量的增加，大量杂质溶出，桑葚渣的酶抑制剂提取率降低[11]。所以对于α-淀粉酶而言，料液比选择1∶30、1∶40、1∶50(g·mL-1)进行正交试验，而对于α-葡萄糖苷酶而言，料液比选择1∶20、1∶30、1∶40(g·mL-1)用于进一步优化。

表2α-淀粉酶活性抑制体系

Table2Reaction system of α-amylase inhibitory activity

处理Treatmentα-淀粉酶α-amylase/μL抑制剂Inhibitor/μL0.75%可溶性淀粉0.75% soluble starch/mLDNS/mL空白管Blank tube(A)50—11空白对照Blank control(B)——11抑制剂管Inhibitor tube(C)502511背景对照Background control(D)—2511

柱状图上无相同小写字母的表示各组间差异显著(P<0.05)。下同。The different lowercase letters above the columns represented statistically significant differences among treatments (P<0.05). The same as below.图1 料液比对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率的影响Fig.1 Effects of solid-liquid ratio on inhibition rate of α-amylase and α-glucosidase activities

2.1.2 超声时间对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制率的影响

如图2，当超声时间为1.5 h时，提取液对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，分别为73.2%和75.9%，其趋势都为先升高后降低。这可能体现了提取量随时间延长的积累效应，但是过长时间的加热提取也会使降糖因子遭到破坏[12]。故选择时间为1.0、1.5、2.0 h用于进一步优化。

图2 超声时间对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制率的影响Fig.2 Effects of ultrasonic time on inhibition rate of α-amylase and α-glucosidase

2.1.3 超声温度对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制率的影响

如图3，当超声时间为60 ℃时，抑制剂对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，分别为64.2%和66.7%。这可能是由于随着超声温度升高，分子动能增加、运动速度加快，渗透、扩散加快，使降糖物质更易转移到溶剂中的缘故。然而，当温度继续升高，对酶的抑制效果下降，这可能与降糖物质在高温条件下被氧化破坏有关[13]。故选择温度为50、60、70 ℃用于进一步优化。

2.1.4 超声功率对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制率的影响

如图4，不同超声功率提取的桑葚渣水提液对α-淀粉酶的抑制率先升高后降低，超声功率为300 W时，对α-淀粉酶的抑制率最高为49.4%，而在超声功率为350 W时，对α-葡萄糖苷酶的抑制率最高为53.9%，这是由于随着超声波功率的增大，提取液各分子动能增加，超声波的空穴效应得到加强，使得降糖物质的溶出速度加快。但随着超声功率的继续增大，降糖效果又有所下降，这可能是因为超声功率过高，分子运动过于剧烈，加强了降糖物质和其他成分之间的反应而使其遭到破坏，导致降糖效果下降[9]。故对于α-淀粉酶而言，超声功率选择200、300、350 W进行正交试验，而α-葡萄糖苷酶而言，超声功率选择300、350、400 W用于进一步优化。

图3 超声温度对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制率的影响Fig.3 Effects of ultrasonic temperature on inhibition rate of α-amylase and α-glucosidase

图4 超声功率对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制率的影响Fig.4 Effects of ultrasonic power on inhibition rate of α-amylase and α-glucosidase

2.2 正交试验

影响桑葚渣水提液降糖活性的因素不是孤立的，它们之间是相互关联的。现选择超声时间(A)、料液比(B)、超声温度(C)、超声功率(D)4个因素进行4因素3水平的正交试验，以α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶为指标，确定最佳的工艺条件。正交试验各个因素水平设置见表3、表4。

以α-淀粉酶的抑制活性为指标，用正交试验对桑葚渣α-淀粉酶抑制剂提取工艺条件进行优化，正交试验结果与分析见表5，方差分析结果见表6。

正交试验结果如表5所示。影响α-淀粉酶的抑制活性的因素依次为超声时间>料液比>超声温度>超声功率，对α-淀粉酶的抑制活性最佳的提取条件为A2B2C3D2，即超声时间1.5 h，料液比1∶40(g·mL-1)，超声温度70 ℃，超声功率350 W。在此最优条件下进行3次验证试验，所得的桑葚水提液对α-淀粉酶的抑制率为78.6%。

表3以α-淀粉酶为指标的正交试验因素水平表

Table3Orthogonal test factor table with alpha-amylase as index

水平LevelA超声时间Ultrasonic time/hB料液比Solid-liquidratio/(g·mL-1)C超声温度Ultrasonic temperature/℃D超声功率Ultrasonic power/W11.01∶305030021.51∶406035032.01∶5070400

表4以α-葡萄糖苷酶为指标的正交试验因素水平表

Table4Orthogonal test factor table with alpha-glucosidase as index

水平LevelA超声时间Ultrasonic time/hB料液比Solid-liquidratio/(g·mL-1)C超声温度Ultrasonic temperature/℃D超声功率Ultrasonic power/W11.01∶205020021.51∶306030032.01∶4070350

表5对α-淀粉酶的提取工艺优化正交试验结果表

Table5Optimization of orthogonal test results for extraction process of alpha-amylase

试验号TestNo.ABCDα-淀粉酶抑制率Inhibition rate ofa-amylase/%1111155.702122260.653133356.284212366.715223170.456231264.507313248.808321350.519332145.33k157.5457.0755.9057.16k267.2259.5457.5657.98k347.2155.3758.5156.83R9.335.171.610.15

由表6的方差分析可知：在各个因素中，超声时间对α-淀粉酶的抑制率的影响极显著，料液比对α-淀粉酶抑制率的影响比较显著，而提取温度、超声功率对α-淀粉酶抑制率的影响不显著。

以α-葡萄糖苷酶的抑制活性为指标，用正交试验对桑葚渣α-葡萄糖苷酶抑制剂提取工艺条件进行优化，正交试验结果与分析见表7，方差分析结果见表8。

正交试验结果如表7所示。影响α-葡萄糖苷酶的抑制活性的因素依次为超声时间>料液比>超声温度>超声功率，对α-葡萄糖苷酶的抑制活性最佳的提取条件为A2B3C1D3，即超声时间1.5 h，料液比1∶40(g·mL-1)，超声温度50 ℃，超声功率350 W。在此最优条件下进行3次验证试验，所得的桑葚水提液对α-葡萄糖苷酶的抑制率为81.4%。

由表8的方差分析可知，在各个因素中，超声时间对α-葡萄糖苷酶的抑制率的影响极显著，料液比、提取温度对α-葡萄糖苷酶抑制率的影响显著，而超声功率对α-葡萄糖苷酶抑制率的影响不显著。

表6正交试验结果方差分析

Table6Variance analysis of orthogonal experiments results

方差来源Source of varianceABCD误差Error 总和Total 离差平方和Sum of squares of deviations541.94 41.60 3.91 1.15 1.15 588.61自由度 Freedom2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 8.00 均方Mean square270.97 20.80 1.96 0.58 0.58 F值F value469.72∗∗36.06∗3.39 1.00

**表示极显著(P<0.01)；*表示显著(P<0.05)。下同。

** indicated extremely significant difference (P<0.01)；* indicated significant difference (P<0.05). The same as below.

表7α-葡萄糖苷酶的提取工艺优化正交试验结果表

Table7Optimization of orthogonal test results for extraction process of alpha-glucosidase

试验号TestNo.ABCDα-葡萄糖苷酶酶抑制率Inhibition rate of alpha-glu-cosidase/%1111154.23 2122251.65 3133356.28 4212368.71 5223172.45 6231278.50 7313259.80 8321368.51 9332165.33 k154.05 60.91 67.08 64.00k273.22 64.20 61.90 63.32k364.55 66.70 62.84 64.50R19.17 5.79 5.18 1.18

3 结论

本实验以桑葚渣为原料，以α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制率为评价指标，考查超声温度、超声时间、料液比、超声功率对水提液抑制酶活性的影响。在单因素试验结果的基础上，采用正交试验优化超声辅助提取的工艺参数，得出对于α-淀粉酶抑制率最佳的工艺参数为提取温度70 ℃、超声时间1.5 h、料液比1∶40(g·mL-1)和超声功率350 W。α-葡萄糖苷酶抑制率最佳的工艺参数为提取温度50 ℃、超声时间1.5 h、料液比1∶40(g·mL-1)和超声功率350 W。由于提取温度对于α-淀粉酶抑制率的影响不显著，对α-葡萄糖苷酶抑制率的影响比较显著，因此提取温度选择50 ℃，以保证提取液对于两种酶的抑制活性都较高。综上，两种酶抑制率最佳的工艺参数为提取温度50 ℃、超声时间1.5 h、料液比1∶40(g·mL-1)和超声功率350 W，所得的桑葚渣提取液对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制率分别为76.4%、81.4%。研究结果可为工业化提取桑葚渣中的降糖功能因子、实现桑葚渣的高值化利用提供技术依据。

表8正交试验结果方差分析

Table8Variance analysis of orthogonal experiments results

方差来源Source of varianceABCD误差Error总和Total 离差平方和Sum of squares of deviations552.70 50.60 45.71 2.12 2.12 651.13 自由度 Freedom2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 8.00 均方Mean square276.35 25.30 22.86 1.06 1.06 F值F value260.90∗∗23.88∗21.58∗ 1.00